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RNAi:制備siRNAs的方法

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發表時間:2020-07-29 16:55作者:武漢新啟迪生物Xinqidibio來源:www.donghu8.com

RNAi:制備siRNAs的方法

越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNAsmall interfering RNAs,siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA,這個過程就是RNA干擾途徑(RNA interference pathway)。RNAi的應用包括功能基因組學,藥物靶篩選,細胞信號傳導通路分析等等。

    目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括

· 化學合成

· 體外轉錄

· 長片斷dsRNAsRNase III 類降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)

· siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs

· PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達

    前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAsDNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優點和缺點。哪種是最好的方法,其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法,優點和缺點,以及它們最適合的應用。

siRNA的設計

    除了方法3以外,其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響,盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說,每個目標序列設計3—4siRNAs,在后面的實驗中選擇最有效的那個。網上有提供免費的siRNA設計工具。

體外制備

1.化學合成

    盡管化學合成是最貴的方法,但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括AmbionQiagen公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高,定制周期長,特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高,為一個基因合成3—4siRNAs 的成本就更高了,比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。

最適用于:已經找到最有效的siRNA的情況下,需要大量siRNA進行研究
不適用于:篩選siRNA等長時間的研究,主要原因是價格因素

2.體外轉錄

    通過體外轉錄的方法可以合成siRNAs,這樣的成本相對化學合成法而言比較低,是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。以Silencer   siRNA Construction   Kit為例,一旦得到DNA Oligo模版(這個還是需要DNA合成的,不過DNA合成的成本就比較低了),只要24小時就可以,不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規模受到限制,雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs,但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比,還是需要占用研究人員相當的時間——畢竟,化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學合成siRNAs較高濃度得到的效果(0.5-20 nM vs. 50-100 nM   per transfection ,圖2

最適用于:篩選siRNAs,特別是需要制備多種siRNAs,化學合成的價格成為障礙時。
不適用于:實驗需要大量的,一個特定的siRNA。長期研究。


    

Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting ?-Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambion's Silencer? siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 μl siPORT? Lipid (Ambion) according to the manufacturer's protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human ?-Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in >_ 95% reduction in ?-actin protein levels.

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版,用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化,得到一眾siRNAs“混合雞尾酒。在除掉沒有被消化的dsRNA后,這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞,方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。3.RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

    dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟,為研究人員節省時間和金錢(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點也很明顯,就是有可能引發非特異的基因沉默,特別是同源或者是密切相關的基因?,F在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響(1-4)。Ambion公司曾經用它的Silencer   siRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關閉幾個基因,包括c-fos, GAPDH, La, ?-actin, Ku-70。

最適用于:快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型
不適用于:長時間的研究項目,或者是需要一個特定的siRNA進行研究,特別是基因治療

Figure 3. Gene Silencing with the Silencer? siRNA Cocktail Kit. A population of siRNAs targeting 200 nt of the Ku-70 mRNA was prepared with the Silencer siRNA Cocktail Kit (RNase III) and transfected into HeLa cells at a final concentration of 100 nM. Cells were analyzed 48 hours later by immunofluorescence. Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.

 體內表達

    前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs,并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于:從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達載體

    多數的siRNA表達載體依賴3RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達(1–4)。這3類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA,而且它是通過添加一串(36個)U來終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火,克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆,這個過程需要幾天的時間,同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴增,這個優點足以彌補所有缺陷,特別是當載體在實驗中確實有效的時候。

    毫無疑問,siRNA表達載體的優點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選,也有助于富集帶質粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題。

    最近多個廠家開始研究逆轉錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達,其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究,避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便。

最適用于:已知一個有效的siRNA序列,需要維持較長時間的基因沉默,或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。
不適用于:篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作)

Figure 4. Long Term Silencing of GFP with pSilencer? 2.1-U6 hygro. HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert. Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an "empty" siRNA expression vector.


5. siRNA表達框架

    siRNA表達框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版,能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用,包括一個RNA pol III啟動子,一段發夾結構siRNA,一個RNA pol III終止位點。和siRNA表達載體不同的是,SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟,可以直接由PCR得到,不用一天的時間。因此,SECs成為篩選siRNA的最有效工具,甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配!如果在PCR兩端添加酶切位點,那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。

    這個方法的主要缺點是PCR產物很難轉染到細胞中。如果有適合的新型轉染試劑能提高SEC的轉染效率的話,那問題就可以解決了。另外,沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規模制備。

    Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇,并已經過c-fos基因抑制的檢驗。

最適用于:篩選siRNA序列,在克隆到載體前篩選最佳啟動子
不適用于:長期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了)


    
運用RN

Figure 5. Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), and human H1 (Hu-H1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph.

Ai來誘導基因表達的沉默是一種制備基因功能缺失表型的有效的新方法。下表總結了5中不同的制備siRNA的方法。小結

比較項目

化學合成

體外轉錄

RNase III降解dsRNA

siRNA
表達載體

PCR
表達框

材料需求

21-mer RNA
oligos(一對)

29-mer DNA oligos(一對)

轉錄模版 (200-1000bp,兩側帶T7 啟動子)

55-60-mer DNA oligos(一對)

~50-mer DNA oligos(一對)

全部制備/合成時間所需時間

4—2

24 小時 + DNA oligo合成時間

1 + 轉錄模版制備時間

5天以上 + DNA oligo合成時間

~ 6 小時 + DNA oligo合成時間

個人所需操作時間

幾乎不需要*

中等

中等

中等

是否需要驗證和尋找最有效siRNA

需要

需要

不需要

需要

需要

能否標記siRNA (例如用于熒光顯微鏡分析siRNA進入細胞過程或者在細胞中的定位)

不能

不能

轉染的相對難易程度

可篩選性 (例如抗生素篩選)

不可以

不可以

不可以

可以

不可以

能否用于長效抑制

不可以

不可以

不可以

可以(抗生素篩選)

不可以

能否大規模制備

可以

有限

有限

可以

有限

檢測總體轉染效率

不可以

不可以

不可以

可以

不可以

每個基因的相對費用(不包含人力)

中等

中等

中等

*取決于合成后是否包含純化、去保護,以及廠家提供的是已經退火的即用型雙鏈還是凍干的單鏈


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