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PCR技術簡史

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發表時間:2020-07-29 17:00作者:武漢新啟迪生物Xinqidibio來源:www.donghu8.com

PCR技術簡史
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史,本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術,Korana1971年最早提出核酸體外擴增的設想:經過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。
PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制,只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適的緩沖體系,DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段,其缺點是:①Klenow酶不耐高溫,90℃會變性失活,每次循環都要重新加。引物鏈延伸反應在37℃下進行,容易發生模板和引物之間的堿基錯配,其PCR產物特異性較差,合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點,但由于Klenow酶不耐熱,在DNA模板進行熱變性時,會導致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期,給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR,其擴增的DNA片段很均一,真實性也較高,只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次,仍需加入新酶。1988Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點:耐高溫,在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。在熱變性時不會被鈍化,不必在每次擴增反應后再加新酶。大大提高了擴增片段特異性和擴增效率,增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率,因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別,將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。


文章分類: 分子技術資料
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