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EWSR1-ATF1依賴的3D連接調節透明細胞肉瘤的致癌和分化程序

 二維碼
發表時間:2022-04-28 11:12作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

染色體易位產生的致癌融合蛋白在癌癥中起主要作用。其中,EWSR1和轉錄因子之間的融合產生具有強大染色質調節活性的癌基因,能夠在許可的前體細胞中建立復雜的基因表達程序。在這里,我們定義了透明細胞肉瘤的表觀遺傳學和三維連接景觀EWSR1-ATF1融合基因。我們發現EWSR1-ATF1表現出獨特的DNA結合模式,需要EWSR1結構域并促進ATF1重定位到新的遠端位點,導致染色質活化和控制原發性CCS腫瘤中觀察到的致癌和分化信號的3D網絡的建立。相反,EWSR1-ATF1缺失導致3D連接的顯著重構,包括促進神經嵴相關發育程序的調節回路的出現??傊?,我們的研究闡明了EWSR1-ATF1利用表觀遺傳機制在CCS中建立調控網絡,并指出神經嵴譜系中的前體細胞是這些腫瘤起源的候選細胞。

介紹

在許多類型的癌癥中,調節基因表達的機制的改變是關鍵的致癌事件。這些事件包括轉錄因子(TF)和染色質調節因子的突變,以及DNA甲基化模式、組蛋白修飾和更高級3D染色質結構的變化1。EWSR1融合蛋白是一類癌基因,其特征在于EWSR1的朊病毒樣無序N-末端結構域與多種TF的融合。最典型的例子是EWSR1-FLI1尤文肉瘤融合蛋白,其中EWSR1的存在使得融合蛋白能夠結合野生型(wt) FLI1不能到達的基因組位置。因此,EWSR1-FLI1可以作為先鋒因子激活從頭增強子,形成腫瘤細胞的表觀遺傳景觀和特性2,3。其他EWSR1融合蛋白,由與其他TF融合的相同EWSR1結構域組成,仍然不太清楚,但預計也具有異常轉錄調節功能。

透明細胞肉瘤是一種罕見的軟組織腫瘤,復發和轉移率高,5年和10年總生存率低(分別為50%和38%)4。CCS最常見于年輕人四肢的軟組織,手術切除是治療的主要方式,一些患者受益于額外的放療4,5。CCS以前被稱為軟組織惡性黑色素瘤,因為它的組織學和分子學與皮膚黑色素瘤(MM)相似,但染色體易位t(12;22)(q13;q12),或者不太頻繁的t(2;22)(q33;q12)有助于將該腫瘤定義為一個獨立的實體6,7。雖然CCS可能顯示額外的基因組畸變,t(12;22)(q13;q12)是在超過90%的病例中發現的唯一的基因改變,以及由此產生的EWSR1-ATF1融合基因被認為是這種疾病的主要驅動因素(https://mitelmandatabase.isb-cgc.org).單獨的EWSR1-ATF1表達足以在小鼠中誘導CCS樣腫瘤,并且已經提出來源于間充質或神經嵴譜系的干細胞特別允許EWSR1-ATF1依賴性轉化8,9,10.

類似于其他EWSR1融合蛋白,EWSR1-ATF1編碼含有EWSR1轉錄激活域和at f1 DNA結合和蛋白質二聚化域的異常TF。EWSR1-ATF1的激活特性依賴于EWSR1和ATF1,盡管通過相同的cAMP響應元件(CRE基序)起作用,但比wt ATF1的激活特性強11,12。ATF1屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP) TFs的ATF1/CREB/CREM亞家族,在活化、磷酸化狀態下結合CRE基序作為同源或異源二聚體13,14。染色質免疫沉淀(ChIP)研究類似地證明了EWSR1-ATF1與靶基因啟動子和/或增強子中的CREB/ATF1基序的直接結合,加強了ATF1結構域賦予融合蛋白DNA結合特異性的概念8,15,16.

有趣的是,兩個特征將EWSR1-ATF1與其他EWSR1融合蛋白區分開來。首先,EWSR1-ATF1與多種腫瘤類型相關,包括廣泛的組織學譜,并在臨床侵襲性和預后方面存在差異。除了CCS,這些實體包括血管瘤樣纖維組織細胞瘤(AFH)、肌上皮腫瘤、透明細胞癌、牙源性透明細胞癌、間皮瘤和粘液樣間葉腫瘤17,18。第二,wt ATF1的表達保留在CCS中,與含有EWSR1的融合蛋白驅動的幾種肉瘤相反,其中EWSR1融合配偶體的wt形式的表達丟失2,19??傊?,這些觀察表明EWSR1-ATF1的致癌特性可能是細胞背景依賴性的,并依賴于相應前體細胞的預先存在的景觀。他們還指出wt ATF1在這些腫瘤的發病機理中的潛在參與,并強調了我們對驅動這些惡性腫瘤的分子基礎的有限了解。

在這項工作中,我們定義了CCS細胞系、原發性腫瘤和間充質干細胞(MSCs)中與EWSR1-ATF1結合位點相關的全基因組染色質和DNA可及性狀態。結合3D核構象和基因表達譜,我們的研究揭示了與EWSR1-ATF1相關的基因調控網絡,并描述了這種融合在建立以原發性CCS腫瘤為特征的增殖和分化程序中的作用,并可能是與MM生物學相似性的基礎。相反,我們發現EWSR1-ATF1缺失后激活的轉錄程序與人類單細胞圖譜中的神經嵴譜系相關,并顯示了與潛在CCS起源細胞的聯系??傊?,我們的研究表明EWSR1-ATF1如何重新配置CCS中的基因調控網絡,以促進致癌程序并阻止正常分化途徑。

結果

CCS中的EWSR1-ATF1結合位點不同于內源性野生型ATF1

為了研究EWSR1-ATF1在CCS中的功能,我們首先在兩種成熟的CCS細胞系(DTC1和SU-CCS-1)中鑒定了EWSR1-ATF1結合位點。假定wt ATF1在CCS細胞中表達,我們通過將EWS R1(N-末端)的芯片測序(ChIP-seq)結果與at f1(C-末端)的信號重疊來定義EWSR1-ATF1結合位點。該方法定義了一組2385個EWSR1-ATF1峰(補充圖。1a).大多數EWSR1-ATF1峰(84%)與遠端區域相關,其余16%的峰位于基因啟動子(ts)處(圖。1a).相反,60%由wt ATF1結合的峰(含有ATF1信號,但沒有EWSR1信號)位于啟動子處(補充圖。1b).為了進一步評估EWSR1-ATF1和wt ATF1之間基因組分布的差異,我們檢測了HepG2和K562細胞中ENCODE財團產生的wt ATF1的ChIP-seq譜。這些圖譜還顯示結合主要發生在TSS區域(HepG2: 77%,K562: 70%,補充圖。1b).此外,EWSR1-ATF1結合的遠端位點在其他細胞類型中觀察到的頻率較低,因為它們在ENCODE (GSE29692)分析的113種人類細胞類型中顯示較低的平均DNAse I信號20,與wt ATF1位點相比(圖。1b).這些觀察表明,盡管共享相同的DNA結合結構域,EWSR1-ATF1結合一組不同的增強子元件。值得注意的是,在原發性CCS腫瘤中也觀察到相同的EWSR1-ATF1結合譜(圖。1c).這些發現使人想起尤因肉瘤中的EWSR1-FLI1融合蛋白,其中EWSR1的朊病毒樣結構域使其能夠與一組新的腫瘤特異性位點結合21,并表明EWSR1-ATF1也可能獲得類似的表觀遺傳重塑特性。FUS、TAF15和EWSR1蛋白的N-末端部分已被證明直接與SWI/SNF染色質重塑復合物相互作用22,表明EWSR1-ATF1也可能與這種復合物相互作用。為了驗證這一假設,我們在DTC1細胞中進行了免疫共沉淀(co-IP)研究,研究EWSR1-ATF1 / wt ATF1與核心SWI/SNF成分BRG1之間的相互作用。雖然ATF1 C抗體能夠與EWSR1-ATF1和wt ATF1一起共IP BRG1,但BRG1抗體選擇性地拉低EWSR1-ATF1(補充圖。1c),表明與SWI/SNF復合物的相互作用是融合蛋白的一種新形態特性,這至少可以部分解釋其獨特的染色質結合模式。

圖1:與wt ATF1相比,EWSR1-ATF1顯示出獨特的結合模式。
figure 1

aDTC1和SU-CCS-1細胞系共有的2385個共有EWSR1-ATF1結合位點的基因組分布,說明EWSR1-ATF1優先結合遠端基因組區域。b2011遠端EWSR1-ATF1位點和516 wt ATF1結合的遠端位點之間的DNAse I超敏反應圖譜比較,橫跨113種不同的細胞類型,顯示在其他細胞類型中融合蛋白結合位點的DNA可及性模式更受限制。c 頂部面板:熱圖描繪了在DTC1和SU-CCS-1細胞系以及三個原發性CCS腫瘤中2011 EWSR1-ATF1結合遠端位點的EWSR1 N、ATF1 C、H3K4me1、H3K27ac和ATAC信號強度。底截鑲板:374個TSS相關的EWSR1-ATF1結合位點的EWSR1 N、ATF1 C、H3K4me3、H3K27ac和ATAC信號強度。對于每個熱圖,顯示了以EWSR1-ATF1峰為中心的20 kb區域。信號按ATF1 C強度排序。d2011遠端EWSR1-ATF1結合區的從頭基序富集分析。顯示了鑒定的前三個基序。二項式p值由模體富集軟件HOMER給出。e,MERTK和ID4基因組基因座的ChIP-seq track,說明DTC1和初級CCS腫瘤細胞之間相似的EWSR1-ATF1結合和染色質活性分布,以及在EWR1-ATF1位點存在TFAP2A、SOX10和MITF。

為了確定與EWSR1-ATF1結合位點相關的染色質狀態,我們接下來在兩個復制的DTC1和SU-CCS-1以及原代CCS中分析了主要組蛋白修飾H3K4me1、H3K27ac和H3K4me3。此外,我們使用ATAC序列生成了DTC1和SU-CCS-1細胞的染色質可及性圖譜。發現大多數EWSR1-ATF1遠端結合位點與活性增強子元件相關,以H3K4me1、H3K27ac和ATAC信號的存在為標志23,24(圖。1c).類似地,TSSs的EWSR1-ATF1結合位點與H3K4me3、H3K27ac和ATAC信號相關(圖。1c),這與融合蛋白在兩個調控區都表現為轉錄激活因子的概念相一致。值得注意的是,三種原發性腫瘤CCS1-CCS3在EWSR1-ATF1峰處顯示相似的染色質狀態分布圖(圖。1c).鑒于EWSR1-ATF1在其他腫瘤類型中的表達已被確定,我們在兩種原發性AFH腫瘤中進行了類似的染色質輪廓分析。AFH和CCS在組織學和行為學水平上有顯著差異。AFH既沒有表現出透明細胞形態,也沒有表現出黑素細胞分化表型,臨床病程相對緩慢,很少發生轉移。因此,AFH患者的預后明顯好于被診斷為CCS的患者25。有趣的是,2385 EWSR1-ATF1結合位點的AFH染色質圖譜與原代CCS和CCS細胞系中的僅有部分相似性(補充圖。1d左邊的).H3K4me1和H3K27ac峰的全基因組調查揭示了高質量的信號,排除了這些結果可能反映AFH較低的ChIP-seq質量的可能性(補充圖。1d正確).因此,我們的觀察表明,EWSR1-ATF1的作用可能受腫瘤及其來源細胞的固有特性的制約。

在遠端EWSR1-ATF1結合位點最高度富集的基序是共有的CRE基序,其次是TFAP2和SOX相關基序(圖。1d).因為CREB家族的轉錄因子識別基因組中的CRE半位點(TGACG/CGTCA)26,對未被鑒定為具有完整CRE位點(TGACGTCA)的EWSR1-ATF1峰區域的短CRE基序(4,5,6 nt)的富集進行了查詢。事實上,CRE半位點被確定為這些區域中的頂級基序(補充圖。1e).我們的結果與以前發表的研究一致,這些研究表明EWSR1-ATF1的DNA結合特異性是由ATF1 DNA結合結構域賦予的。8,11。TFAP2A(又名AP-2α)和SOX10在神經嵴干細胞的生物學中起著重要作用27EWSR1-ATF1調控元件上這些基序的富集可能反映了未分化NC衍生物中CCS的推測來源8。52%的帶有CRE基序的EWSR1-ATF1結合位點和50%的含有CRE半位點的位點共富集TFAP2和/或SOX基序(補充圖。1f),表明這些TF可能與融合蛋白一致地結合那些基因組位點。為了研究融合蛋白和NCSC相關TF之間的潛在協同作用,我們通過ChIP-seq對兩種CCS細胞系中的TFAP2A和SOX10結合位點進行了分析,并觀察到這兩種TF存在于2385個EWSR1-ATF1結合位點的大部分(TFA p2a:dt C1中59 %, SU-CCS-1中82 %, so X10:dt C1中56 %, SU-CCS-1中83%,補充圖。第一代).此外,已知TFAP2A / SOX10和MITF在調節黑素細胞分化方面的功能協同作用28考慮到這一專題小組在CCS發展中的關鍵作用15我們還在兩種細胞系中生成了MITF的DNA結合圖譜。與TFAP2A和SOX10相似,MITF在EWSR1-ATF1結合位點顯示出顯著的共占用(DTC1為73%,SU-CCS-1為89%,補充圖。第一代).值得注意的是,發現與EWSR1-ATF1以及TFAP2A、SOX10和MITF結合的增強子接近基因,例如默克ID4(圖。1e)與其他軟組織肉瘤和黑色素瘤相比,先前已顯示在CCS中選擇性表達29,以及許多新穎的目標??傊?,這些結果表明,融合蛋白可能劫持腫瘤前體細胞預先存在的TF網絡,以建立其致癌程序。

EWSR1-ATF1敲除顯示對染色質激活狀態的顯著影響

接下來,我們試圖確定EWSR1-ATF1對染色質活性的功能影響。為此,我們使用了基于siRNA的策略來減少DTC1和SU-CCS-1細胞系中的融合轉錄物。選定的siRNA專門針對EWSR1-ATF1斷點序列而不改變wt的表達ATF1(補充圖2a),正如在早期研究中觀察到的10。轉染后96小時觀察到最佳敲除(KD)效率(圖。2a),為所有后續分析提供時間點。EWSR1-ATF1缺失細胞的染色質分布顯示所有結合位點的ATF1 C信號顯著減少(圖。2b,c左邊的),驗證我們的EWSR1-ATF1參比峰組的相關性??偟膩碚f,這兩種細胞系對EWSR1-ATF1缺失的反應相似,增強子活性顯著降低,如遠端結合位點H3K4me1和H3K27ac信號的降低所示(圖。2c中間),以及在TSS位點H3K4me3和H3K27ac信號的減少(補充圖。2b).重要的是,染色質活化的減少與相同基因組區域的DNA可及性的顯著降低相關,如ATAC-seq所評估的(圖。2c正確和補充圖。2b).因此,我們觀察到接近CCS特異性基因的增強子的活性和可及性降低默克ID4(圖。2d).相反,全基因組H3K27ac信號顯示EWSR1-ATF1缺失的DTC1和SU-CCS-1腫瘤細胞減少和增加(補充圖。2c),證明了它們全球表觀遺傳景觀的深刻變化。這些結果證實了EWSR1-ATF1在其結合位點誘導染色質活化的能力,并進一步表明融合蛋白在維持基礎(H3K4me1)和活化(H3K27ac)增強子狀態中的作用。觀察到的ATAC信號的減少也表明EWSR1-ATF1可能通過類似于在EwS中對EWSR1-FLI1所鑒定的開創性特性參與了產生新的遠端調控元件2.

圖2: EWSR1-ATF1缺失降低了染色質活化和DNA可及性。
figure 2

a用靶向融合基因(siEA 72小時和96小時)或不相關序列(siCTL 96小時)的siRNA轉染的DTC1和SU-CCS-1細胞系中EWSR1-ATF1蛋白水平的蛋白質印跡分析。微管蛋白水平用作加載對照。該實驗獨立重復了兩次,結果相似。源圖像在源數據文件中提供。b顯示用siEA或siCTL siRNAs轉染96小時的DTC1和SU-CCS-1細胞中2385 EWSR1-ATF1結合位點的ATF1 C ChIP-seq信號顯著減少的復合圖c 左側面板:熱圖描繪了在96小時時,在siEA或siCTL處理的DTC1和SU-CCS-1細胞中,ATF1 C ChIP-seq信號在2011 EWSR1-ATF1結合的遠端位點上的分布。熱圖顯示了以EWSR1-ATF1峰為中心的20 kb基因組區域,其由ATF1 C信號強度排序。中間面板:H3K4me1的合成圖(上部面板)和H3K27ac(下面板s)信號在siEA或siCTL處理的DTC1和SU-CCS-1細胞中的2011 EWSR1-ATF1結合的遠端位點,在96小時,顯示EWSR1-ATF1缺失時兩種增強子標記的減少。右側面板:96小時時siEA或siCTL轉染的DTC1和SU-CCS-1細胞中ATAC信號的合成圖,顯示與融合蛋白丟失相關的染色質可及性降低。d在MERTK和ID4基因組座位上的ChIP-seq和ATAC-seq軌跡(如圖。1e)在siEA或siCTL處理的DTC1細胞中,顯示了由EWSR1-ATF1的缺失誘導的染色質活性和可及性的降低。EWSR1-ATF1結合區域以灰色突出顯示。

EWSR1-ATF1缺失后觀察到的殘留染色質激活可能是由于我們實驗的時間框架短,或者可能是由于協同調節EWSR1-ATF1活性的TF。為了研究EWSR1-ATF1和它的協同TF網絡之間的相互依賴性,我們在EWSR1-ATF1缺失的SU-CCS-1細胞中產生了TFAP2A、SOX10和MITF的全基因組結合譜。與融合蛋白招募這些TF并劫持腫瘤前體細胞的轉錄網絡的概念一致,在去除融合蛋白后,所有三種TF都從EWSR1-ATF1結合位點被顯著置換(補充圖。2d).總之,這些結果定義了一個與EWSR1-ATF1相關的TF網絡,其染色質占據部分依賴于融合蛋白的存在。

野生型ATF1存在于EWSR1-ATF1結合位點的子集

從封閉的染色質狀態到完全活躍的染色質狀態的轉變需要協同的TFs和染色質重塑復合物和共激活物之間的相互作用24?;趙t ATF1在其他細胞模型中作為激活劑的作用13,30我們推斷,它在CCS中表達的維持,加上在EWSR1-ATF1結合位點ATF1基序的富集,可能有利于EWSR1-ATF1和wt ATF1在染色質激活中的合作。為了驗證這一假設,我們在DTC1和SU-CCS-1細胞系以及一個原代CCS中,使用特異性靶向融合蛋白中丟失的ATF1 N-末端部分(at f1 N)的抗體,通過ChIP-seq評估了wt ATF1在EWSR1-ATF1結合位點的占據程度。發現Wt ATF1存在于兩種細胞系的大多數EWSR1-ATF1結合位點(DTC1中62.5%,SU-CCS-1中75%,圖。3a),并在原發性CCS1腫瘤中得到證實,盡管EWSR1-ATF1位點的百分比較低(38%,圖。3a),這種差異可能與在冷凍腫瘤樣品中分析TF的技術挑戰有關。有趣的是,當在EWSR1-ATF1 KD細胞中描繪wt ATF1占據時,我們觀察到在大多數EWSR1-ATF1結合位點ATF1 N信號顯著降低(圖。3b).值得注意的是,這種減少是在融合蛋白的結合位點選擇性觀察到的,因為我們沒有觀察到在不與EWSR1-ATF1共結合的基因組區域(定義為顯示重疊的ATF1 C和ATF1 N,但缺乏EWSR1 N信號的區域)ATF1 N信號的顯著變化(圖。3b).

圖3: wt ATF1存在于大多數EWSR1-ATF1結合位點。
figure 3

a描述SU-CCS-1和原發性CCS1腫瘤細胞中2011個遠端和374個近端EWSR1-ATF1結合位點的EWSR1 N、ATF1 C和ATF1 N ChIP-seq信號強度的熱圖,說明wt ATF1 TF在融合蛋白結合位點的基因組共占。對于每個熱圖,顯示了以EWSR1-ATF1峰為中心的20 kb區域。信號按ATF1 C強度排序。b顯示ATF1 N相關峰的ChIP-seq信號變化的合成圖(左邊的)還是不(正確)與用靶向融合基因(siEA)或對照(siCTL) siRNAs的siRNA轉染的SU-CCS-1細胞中的EWSR1-ATF1結合。融合蛋白的丟失僅在EWSR1-ATF1結合位點與ATF1 N信號的降低相關,表明融合蛋白募集了wt ATF1。c免疫共沉淀(Co-IP)分析顯示在293 T(左邊的)和DTC1單元格(正確).用V5標記的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)或空載體(CTL)構建體轉染293 T細胞。使用抗V5標簽抗體進行IP,使用抗V5(頂端)或抗ATF1 C(底部)抗體。與對照(CTL) IgG相比,使用抗ATF1 C或-ATF1 N抗體進行DTC1 IPs,使用抗ATF1 C抗體進行蛋白質印跡。該實驗獨立重復了兩次,結果相似。d2011年遠端區域的EWSR1 N、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq得分的相關圖,顯示H3K27ac沉積和wt ATF1存在之間的相關性強于EWSR1-ATF1存在(分別由ATF1 N和EWSR1 N信號表示)。eATF1 N和p300的散點圖(左邊的),或者EWSR1 N和p300(正確)ChIP-seq得分,說明wt ATF1的存在比EWSR1-ATF1更好地與p300占用率相關。f在慢病毒感染后72小時,用靶向wt ATF1轉錄物(shATF1)或不相關序列(shCTL)的shRNA感染的DTC1和SU-CCS-1細胞系中EWSR1-ATF1和wt ATF1蛋白水平的蛋白質印跡分析。微管蛋白水平用作加載對照。該實驗獨立重復了兩次,結果相似。gqPCR分析顯示重量ATF1慢病毒感染后72小時,shATF1- vs shCTL感染的SU-CCS-1 (S)和DTC1 (D)細胞中的轉錄物,以及一組EWSR1-ATF1 / wt ATF1共調節的靶轉錄物。每個條件的三個重復用于計算平均Ct值,然后根據2計算平均相對表達值-δδCt方法相對于shCTL樣本值,并標準化為內源性對照基因磷酸甘油醛脫氫酶。誤差線顯示平均值的標準偏差(n= 3個樣品重復)。該實驗獨立重復了兩次,結果相似。源數據在源數據文件中提供。

這些觀察表明,wt ATF1在EWSR1-ATF1結合位點的占據取決于融合蛋白本身的存在,并且至少可以部分解釋在CCS細胞中觀察到的wt ATF1向遠端基因組區域的重定位。為了驗證EWSR1-ATF1和wt ATF1之間的物理相互作用,我們用編碼C-末端V5標記的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)的表達構建體轉染HEK293T細胞,并用抗V5標記抗體進行co-IP。這種方法證實了EWSR1-ATF1和內源性wt ATF1之間的相互作用,內源性wt at f1在表達EA-CV5但不是空載體感染的293 T細胞(CTL)中共免疫沉淀(圖。3c左邊的).我們還通過使用抗ATF1 C或-ATF1 N抗體進行co-IP,證實了CCS細胞中內源性EWSR1-ATF1和wt ATF1蛋白之間的直接相互作用,表明wt ATF1特異性抗ATF1 N抗體降低了EWSR1-ATF1(圖。3c正確).我們的結果支持EWSR1-ATF1將wt ATF1募集到其結合位點的觀點。因為EWSR1-ATF1結合位點比wt ATF1的結合位點位于更遠的位置(補充圖。1b),這種相互作用導致wt ATF1的基因組重新分布。

EWSR1-ATF1募集野生型ATF1用于染色質活化

我們接下來考慮wt ATF1的募集是否可能在其結合位點支持EWSR1-ATF1的功能。為此,我們通過計算EWSR1 N、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq評分之間的相關性,研究了DTC1和SU-CCS-1細胞中產生的ChIP-seq數據,以確定EWSR1-ATF1遠端位點的wt ATF1占用率和H3K27ac信號強度之間的關聯。EWSR1 N與ATF1 N評分呈顯著相關(r= 0.48,p-值7.4e 115)(圖三維(three dimension的縮寫)),支持EWSR1-ATF1和wt ATF1在那些結合位點的共定位。有趣的是,H3K27ac分數與ATF1 N(r= 0.42,p-值3.54e-88)比EWSR1 N(r= 0.08,p-值0.0002)(圖。三維(three dimension的縮寫)),表明wt ATF1占據可能構成促進增強子活性的重要因素。為了獲得更深入的了解,我們在CCS細胞系中進行了p300芯片序列分析,發現p300評分與ATF1 N(r= 0.71,p-值3.51 e286)比EWSR1 N(r= 0.54,p-值1.67 e137)在EWSR1-ATF1遠端部位(圖。3e).這些結果表明EWSR1-ATF1對wt ATF1的募集可能通過增強p300募集和H3K27ac在融合蛋白結合位點的沉積而參與染色質激活過程。為了驗證這一假設,我們選擇了一種慢病毒shRNA,特異性靶向wt的5’端序列ATF1抄本,不包括在EWSR1-ATF1以及來自DTC1和SU-CCS-1細胞的耗盡的wt ATF1。實現完全敲除的第一次嘗試導致大量細胞凋亡,阻止了任何進一步的下游分析。因此,為了避免這個問題,我們決定微調慢病毒載量和實驗時間,以在慢病毒感染后72小時獲得部分但顯著的wt ATF1缺失,而不影響融合蛋白的表達(圖。3f).盡管在EWSR1-ATF1結合位點ATF1 N信號適度減少,我們觀察到H3K27ac信號伴隨減少(補充圖。3),以及一組基因的表達水平,這些基因的調控元件顯示EWSR1-ATF1和wt ATF1在兩個CCS系中共占(圖。3g),支持wt ATF1參與EWSR1-ATF1轉錄活性的觀點。

為了進一步闡明EWSR1-ATF1的功能貢獻及其與wt ATF1的相互作用,我們轉向了原代兒科間充質干細胞(hpMSCs),一種人類肉瘤亞群的假定前體模型。重要的是,MSCs對EWSR1-ATF1驅動的轉化的允許性已經在轉基因CCS鼠模型中得到證實9。我們將C-末端標記的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)引入hpMSCs(補充圖。4a)并用抗V5標簽、-ATF1 N、-H3K27ac、-H3K4me3和p300抗體通過ChIP-seq以及ATAC-seq分析這些細胞。V5 ChIP-seq鑒定了在CCS細胞中觀察到的60%的EWSR1-ATF1結合位點(圖。4a),這顯示了對結合遠端位置的類似偏向(82%遠端和18% TSS相關)(補充圖)。4a).

圖4: EWSR1-ATF1遠端結合和wt ATF1募集依賴于EWSR1朊病毒樣結構域。
figure 4

ahpMSCs和CCS細胞系之間共有的1432個EWSR1-ATF1-V5峰(EA-CV5)的EWSR1 N和ATF1 C ChIP-seq得分散點圖,顯示了V5信號在所有位點的均勻分布(EA ref峰)。b熱圖(左邊的)描繪了分別在395和340處的ATF1 N信號強度,沒有ATF1和從頭,在hpMSCs (EA-CV5)與對照(CTL)細胞中EWSR1-ATF1-V5結合遠端位點,說明了wt ATF1的從頭募集。顯示了以EWSR1-ATF1峰為中心的20 kb區域。描繪ATAC、H3K27ac和p300在No ATF1和新遠端位點的信號強度的復合圖,顯示融合蛋白募集的wt ATF1增強了其染色質激活特性。chpMSCs中1174個遠端EWSR1-ATF1-V5結合位點的V5、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq評分的相關圖,證實在CCS細胞系中觀察到的融合蛋白結合位點,H3K27ac沉積與wt ATF1 (ATF1 N)存在的相關性好于與EWSR1-ATF1 (V5)存在的相關性。d在113種不同的細胞類型中,在無ATF1、新ATF1和預先存在的hpMSCs EWSR1-ATF1-V5遠端結合位點之間的DNA酶I超敏性圖譜比較,顯示了最初缺乏wt ATF1占據的基因組區域的限制性DNA可及性模式。e柱狀圖描述了在MSCs中EWSR1-ATF1 (EA-CV5)、EWSR1(YS37)-ATF1 (E(YS37)A-CV5)和wt ATF1 (ATF1-CV5)結合位點的基因組分布,使用抗V5抗體通過ChIP-seq進行評估。fChIP-seq和ATAC-seq追蹤顯示了野生型ATF1募集、DNA可及性和染色質活性變化的不同模式左邊的)和重新(正確)hpMSCs中的EWSR1-ATF1-V5結合位點(以灰色突出顯示)。

首先,我們研究了與CCS共享的EA-CV5 hpMSCs中EWSR1-ATF1結合位點的wt ATF1的存在。我們將峰分為3類:由EWSR1-ATF1唯一占據的峰(沒有ATF1,n= 449)或由融合蛋白和wt ATF1共同占據的峰,如果對照細胞中缺少ATF1峰,則定義為從頭開始(n= 398),或者如果ATF1存在則預先存在(n= 475).沒有ATF1和從頭位點在更大程度上位于遠端基因組區域(88%,n= 395,而85%,n= 340),相比之前存在的網站(77%,n= 364)(補充圖。4b),并在EA-CV5細胞中顯示增加的ATAC信號(圖。4b).然而,這兩個類別在H3K27ac激活標記信號上不同。雖然新位點顯示H3K27ac信號與p300募集配對明顯增加,但ATF1位點沒有缺乏這兩種標記的積累(圖。4b).先前存在的位點也表現為EA-CV5細胞中ATAC、H3K27ac和p300信號的增加(補充圖。4c).然而,H3K27ac信號的增加不太明顯,可能是由于可變的預先存在的H3K27ac水平可能調節它們對EWSR1-ATF1介導的激活的反應性。使用N-末端V5標記的EWSR1-ATF1 (NV5-EA)獲得了無ATF1、從頭峰和預先存在的峰類別的類似結果(補充圖。4d).綜上所述,這些結果表明,為了實現染色質的完全激活,EWSR1-ATF1需要wt ATF1的補充及其直接結合位點的協同性。通過計算EWSR1-ATF1、ATF1和H3K27ac之間的芯片評分相關性,觀察到類似的模式。類似于我們在CCS細胞系中的分析(圖。三維(three dimension的縮寫)),H3K27ac與ATF1 N(r= 0.59,p值6.44e-112)比V5(r= 0.24,p-值1.86 e17)(圖4c),表明在EWSR1-ATF1結合位點的H3K27ac沉積可能確實需要wt ATF1協同作用。

EWSR1-ATF1在遠端位點的結合依賴于EWSR1朊病毒樣結構域

在圖1中使用的113種不同細胞類型的相同編碼組中,詢問EWSR1-ATF1位點的三個子集的DNAse I信號。1b揭示了與先前存在的位點相比,ATF1和從頭位點在其他細胞類型中沒有明顯較低的DNAse I敏感性信號(圖。4d).相反,與wt ATF1預先結合的預先存在的位點在大多數其他細胞類型中顯示出很強的DNAse I信號,表明這種TF可以更廣泛地進入基因組區域。鑒于wt ATF1在CCS中的普遍表達及其通過融合蛋白進行的基因組再分布,這些結果可能反映了EWSR1-ATF1將wt ATF1募集到基因組區域的能力,在沒有融合蛋白的情況下,這些區域將保持部分不可接近。他們還提出了EWSR1向EWSR1-ATF1功能提供潛在新形態特性的問題,包括與SWI/SNF重塑復合體相互作用的能力(補充圖。1c).

我們先前證明了EWSR1的朊病毒樣無序結構域使EWSR1-FLI1尤文肉瘤融合蛋白能夠激活wt FLI1不能到達的基因組位置21。這些特性被改變EWSR1 (EWSR1-FLI1 YS37突變體)相變特性的突變所消除。為了研究野生型ATF1向遠端位點的基因組重定位是否存在類似的機制,我們產生了一種EWSR1-ATF1 YS37突變體,并在hpMSCs中表達,同時表達的還有EWSR1-ATF1和野生型ATF1(補充圖。4e).重要的是,發現EWSR1-ATF1 YS37突變體保留了與wt ATF1相互作用的能力(補充圖。4f),盡管失去了β-異x誘導的沉淀特性(補充圖。第四代移動通信技術).為了研究這三種TF的基因組分布,使用抗V5抗體通過ChIP-seq對hpMSCs進行分析,因為所有三種構建體在其C末端都包含V5標簽。與我們之前的結果一致,EWSR1-ATF1的結合模式主要局限于遠端基因組區域(TSS的7%),而YS37突變體顯示啟動子結合顯著增加(TSS的56%),接近wt ATF1的結合模式(TSS的60%)(圖。4e).

總之,我們的結果表明EWSR1-ATF1可以結合非活性位點,在wt ATF1募集后重新啟動染色質激活(圖。4f),而在wt ATF1預先標記的活性基因組區域,EWSR1-ATF1導致染色質活性和wt ATF1占用率的適度增加。我們的hpMSCs結果還說明了EWSR1-ATF1與CCS細胞系中確定的遠端位點的優先結合模式如何依賴于相變特性,并強烈促進wt ATF1的再靶向。

CCS中EWSR1-ATF1結合位點的三維連接性鑒定

鑒于絕大多數EWSR1-ATF1結合位點位于遠端基因組區域,我們接下來試圖通過H3K27ac Hi-ChIP對DTC1和SU-CCS-1腫瘤細胞進行3D染色質構象分析來更好地確定融合蛋白的3D連接性。該技術允許確定與激活標記H3K27ac相關的成環模式,因此提供了識別活性遠端調節位點的3D相互作用的手段31。我們在SU-CCS-1和DTC1細胞中分別鑒定出總共79497和41325個染色質環(圖。5a、b和補充圖。5a),其中48%和32%與EWSR1-ATF1相關。這些觀察強調了融合蛋白在塑造染色質活性和構象方面的重要性,因為EWSR1-ATF1結合位點代表了兩種細胞系中H3K27ac峰的少數,但卻是Hi-ChIP檢測到的大部分染色質環的一部分(圖。5c和補充圖。5b).值得注意的是,與其他H3K27ac峰相比,融合蛋白結合位點與更高數量的環相關,并且這些環更長,具有更高的讀數(圖。5d和補充圖。5c,d).

圖5: EWSR1-ATF1相關的連接性主導了CCS腫瘤細胞的3D景觀。
figure 5

aSU-CCS-1腫瘤細胞中EWSR1-ATF1相關(EA環,紅色)或非相關(非EA環,藍色)染色質環的三維連接,顯示融合蛋白連接環的遠端-遠端相互作用模式。b 左邊的:circos圖描繪了全基因組范圍內所有與EWSR1-ATF1相關或獨立的染色質環。circos內部藍色和紅色信號的高度對應于log10標度中描述的環路長度。對吧:20號染色體放大倍數較高,說明與所有其他環相比,EWSR1-ATF1相關環的長度增加。c顯示H3K27ac峰關聯的柱狀圖(左邊的)和染色質環(正確)帶有EA循環(分別為5121和38095)或非EA循環(分別為22654和41402)。d描繪中位數的箱線圖(左邊的)和強度(正確)的染色質環相關(n= 38095)或不(n= 41402),具有EWSR1-ATF1結合位點。下鉸鏈和上鉸鏈對應于第一和第三四分位數(第25和第75個百分位數)。上須從鉸鏈延伸到離鉸鏈不超過1.5 * IQR的最大值(其中IQR是四分位數范圍)。下須從鉸鏈延伸到最小值,至多為鉸鏈的1.5 * IQR。統計顯著性通過雙側t檢驗(n= 4181對于ATF1錨,n= 16756表示沒有ATF1錨)。e文氏圖顯示了Hi-ChIP鑒定的與SU-CCS-1和DTC1腫瘤細胞中2385 EWSR1-ATF1結合位點相連的直接靶基因的數量。f芯片交互圖(頂端)和染色質環輪廓(底部)用于SU-CCS-1腫瘤細胞中的RRM2基因組座位。還顯示了EWSR1-ATF1 (EA)結合位點和H3K27ac ChIP-seq信號(中間).下圖中的染色質環根據其與融合蛋白結合位點的關聯(EA環,紅色)或不關聯(非EA環,藍色)進行顏色編碼。

然后,我們使用Hi-ChIP譜來定義兩種細胞系中每個EWSR1-ATF1結合位點的直接靶基因,并產生一組在SU-CCS-1和DTC1細胞之間共享的2014直接靶基因(圖。5e,f,補充數據1).在DTC1和SU-CCS-1 Hi-ChIP鑒定的2014個直接靶基因中,有535個在siEA細胞中差異表達(圖。6a),而大多數(n= 417)在EWSR1-ATF1缺失時表達減少。值得注意的是,對417個下調基因的功能分析揭示了它們強烈參與細胞周期調節,與融合蛋白的促癌活性一致(圖。6b左邊的,補充數據1).該基因表達程序在我們的hpMSCs模型中也被激活,其中siEA細胞中下調的大多數直接靶顯示出對EWSR1-ATF1表達的誘導(圖。6b正確).此外,當比較CCS和AFH原發性腫瘤的轉錄譜時,我們觀察到我們下調的靶基因庫在CCS樣品中表達更高(圖。6b, 正確),盡管在兩種腫瘤類型中存在相同的融合基因。

圖6: EWSR1-ATF1連接的環調節細胞增殖程序。
figure 6

a火山圖顯示了在FC = 1.5(虛線)時EWSR1-ATF1缺失(siEA)的細胞相對于對照(siCTL)細胞的基因表達變化,并進行調整p-value = 0.05 (3693個基因)。EWSR1-ATF1直接靶基因。5e在FC = 1.5時差異表達的(n= 535)用紅色標記。雙面的p-數值由lmFit多重線性擬合模型給出,并通過Benjamini & Hochberg校正對多重測試進行調整。b 左邊的:EWSR1-ATF1缺失后下調的417個基因的功能分析,如(a)的生物過程(GO: BP)和規范途徑(CP: Reactome),顯示它們參與細胞周期調節。右:熱圖描繪了來自(a),在表達融合蛋白的HP MSCS(EA-CV5和NV5-EA)與對照(CTL)中,或在原發性CCS和AFH腫瘤中。c散點圖顯示了siCTL和siEA轉染的SU-CCS-1細胞之間H3K27ac相關環的變化。顯示兩倍以上變化的環數以紅色(誘導)和藍色(抑制)顯示。d條形圖顯示EWSR1-ATF1相關(EA結合,橙色和紅色)或獨立(非EA,藍色)環的環數變化。e對照中ST8SIA4A基因組基因座的Hi-ChIP和ChIP-seq信號軌跡(siCTL,左邊的)或EWS R1-at f1-耗盡(siEA,正確)SU-CCS-1細胞。

接下來,我們試圖確定CCS腫瘤細胞中融合蛋白丟失所誘導的連接性變化。為此,通過H3K27ac Hi-ChIP對用siCTL或siEA轉染的SU-CCS-1細胞進行分析,以鑒定成環模式的差異。標準化后,我們在去除了EWSR1-ATF1的SU-CCS-1細胞中發現了25008個減少的環和19107個增加的環(2倍閾值)(圖。6c).在EWSR1-ATF1相關環中觀察到的環數減少最多(圖。6d,e),支持融合蛋白在染色質激活中的作用。相比之下,大多數染色質相互作用的增加與缺乏EWSR1-ATF1結合位點的基因組區域相關(圖。6d, 頂端).

三維連接和染色質活性的協同變化指向候選的CCS起源細胞

我們的小組和其他小組先前已經表明EWSR1-FLI1缺失導致了與MSCs相關的表達程序的出現,MSCs被認為是這種腫瘤的起源細胞32。因此,我們推斷,在EWSR1-ATF1缺失細胞中發現的新的3D連接可能是由調控元件驅動的,這些調控元件控制著與來源的候選CCS細胞相關的轉錄程序。為了評估這一假設,對siCTL和siEA轉染的SU-CCS-1細胞的H3K27ac譜進行了“從頭”H3K27ac區的調查,h3k 27 AC區被定義為在siCTL細胞中顯示少于5個讀數,而在siEA細胞中增加至少4倍的峰。該分析在EWSR1-ATF1缺失的SU-CCS-1細胞中分別產生了4063和1465個“從頭”遠端和近端位點(圖。7a).然后使用這些位點的基因組坐標來詢問匹配的H3K27ac Hi-ChIP圖譜,并定義它們的直接靶基因(圖。7b).使用調整后的p值0.05和FC 1.5截止值,我們在DTC1和SU-CCS-1細胞中鑒定了157個與“從頭”H3K27ac位點相關的基因,這些基因在去除EWSR1-ATF1后被誘導(圖。7c).令人驚訝的是,在誘導的轉錄物中,我們觀察到與EWSR1-ATF1直接結合位點共定位的轉錄物相關的轉錄物,包括TFAP2A、SOX10和MITF(圖。7d和補充數據1).此外,當調查siEA轉染的DTC1和SU-CCS-1細胞的整體RNA-seq譜時,我們還發現了參與黑素體生物發生和黑素沉著的基因的誘導,包括與終末分化的黑素細胞相關的MLANA、TYRP1和PMEL(圖。7d和補充數據1).重要的是,MITF、TFAP和SOX TF家族的DNA基序也在圖1所示的“從頭”遠端位點得到了富集。7a(圖。7e).這表明在去除EWSR1-ATF1后,CCS細胞可能經歷由一組也在融合蛋白結合位點發現的TF驅動的分化變化。與這些觀察結果一致,對157個誘導轉錄物的基因本體分析揭示了它們富集了與NCSC分化和染色質調節相關的功能(圖。7f和補充數據1).

圖7:EWS R1-at f1耗盡點與候選CCS前體細胞的3D連接性變化。
figure 7

a描繪遠端H3K27ac信號的熱圖(頂部面板)和近端(底部面板)SU-CCS-1細胞中的位點,用對照(siCTL,左邊的)或EWSR1-ATF1靶向(siEA,正確)siRNAs,說明了在EWSR1-ATF1缺失的細胞中“從頭”位點的誘導。對于每個熱圖,顯示了以H3K27ac信號為中心的20 kb區域。通過siEA轉染的SU-CCS-1細胞中的H3K27ac強度對信號進行分級。b芯片交互圖(頂端)和染色質環輪廓(底部)用于siCTL或siEA處理的SU-CCS-1腫瘤細胞中的RHOBTB1基因組座位。還示出了H3K27ac芯片序列信號(底部).下圖中的染色質環根據其與融合蛋白結合位點的關聯(EA環,紅色)或不關聯(非EA環,藍色)進行顏色編碼。cDTC1和SU-CCS-1細胞中的基因表達z得分熱圖,用于鑒定作為“從頭”調節位點的靶的157個轉錄物,如在(a),在EWSR1-ATF1耗盡時,在兩種細胞系中顯示FC > 1.5的上調和p值< 0.05。d參與黑素細胞分化的基因的表達z得分,顯示在siEA轉染的DTC1 (D)和SU-CCS-1 (S)細胞中有較高的表達。粗體標記的基因是(c). e4063個“從頭”遠端位點的Homer基序分析顯示于(a).二項式p值由模體富集軟件HOMER給出。f對Wiki途徑(WP)、生物過程(GO: BP)和分子功能(GO: MF)的相同157個基因進行功能分析,顯示該基因庫參與NCSC分化和染色質重塑。g來自五個健康人皮膚樣品(包括表皮和真皮層)的168,103個單細胞的表達譜的UMAP表示。標準化的log2分數用于UMAP生成。黑素細胞、許旺細胞和間質許旺細胞用虛線圓圈標記。h描繪下調的EWSR1-ATF1靶基因的富集分數的箱線圖(底部, n= 393)或上調的“從頭”基因簽名(頂端, n= 154)在16個不同的細胞群中表達。融合蛋白去除后,腫瘤細胞獲得更分化的表型,使人想起黑素細胞和間質施萬細胞。箱形圖顯示了1標準時間到3注冊營養師顯示中間值的數據的四分位數(25–75%)。

鑒于CCS通常出現在皮膚深層,為了更好地了解這些分化變化的本質,我們研究了人類皮膚單細胞圖譜32對于富含417個下調的直接靶基因的原代細胞類型。6A,或圖1中的157個“從頭”基因。7a。該圖譜包括來自五個健康人皮膚樣本的168,103個單細胞,并包括黑素細胞和許旺細胞(SchC),這些細胞以前被認為是CCS的起源細胞(圖。7g).有趣的是,盡管EWSR1-ATF1靶基因庫在組成該圖譜的23種不同細胞類型中沒有顯著富集(圖。7h, 底部),黑素細胞和基質干細胞中的“從頭”基因標記得分(圖。7h, 頂端).為了進一步研究EWSR1-ATF1缺失誘導的分化變化,我們用電子顯微鏡分析了siEA和siCTL轉染的SU-CCS-1細胞,以評估黑素體的存在。黑素體是在表皮黑素細胞中發現的細胞器,黑色素在其中合成和儲存,它們的存在與終末黑素細胞分化有關。有趣的是,在EWSR1-ATF1缺失的細胞中,每個細胞的黑素體數量顯著增加(p < 0.0001,補充圖。6).這些結果與在EWSR1-ATF1缺失的細胞中觀察到的參與黑素體生物發生和成熟的基因表達增加一致,支持CCS可能起源于神經嵴譜系的前體細胞的觀點,并表明融合蛋白可能通過將譜系特異性TFs TFAP2A、SOX10和MITF從其原始結合位點重新定位而誘導細胞重編程為更未分化的狀態。

討論

致癌轉錄因子可以具有不同的效應,從衰老和死亡到轉化,取決于生物學背景。給定細胞類型對這些癌基因的允許性可能在很大程度上取決于預先存在的表觀遺傳和調節景觀。對癌基因驅動的細胞重編程的更好理解可能對設計與標準化療和免疫調節方法協同的腫瘤分化方案有指導意義。這種基于機制的策略可能與肉瘤特別相關,在肉瘤中,腫瘤融合蛋白是主要的致癌驅動因素,并誘導染色質組織和細胞分化的深刻變化。有趣的是,CCS與惡性黑色素瘤(MM)具有形態學和分子學的相似性,這表明這兩種實體可能表達相關的TF網絡和分化程序,其中一些可能調節它們的轉移傾向和對常規治療的抗性。

為了定義CCS中由EWSR1-ATF1控制的轉錄程序,我們將染色質分布圖與核拓撲作圖相結合,以定義該融合蛋白的調控網絡和直接靶庫。我們評估了3D染色質連接的差異,并將這些數據與單細胞表達譜配對,以研究缺乏EWSR1-ATF1時CCS的可塑性及其與這些腫瘤起源的潛在細胞的相關性。值得注意的是,與wt ATF1相比,我們發現EWSR1-ATF1主要結合遠端基因組區域,這一特征在其EWSR1朊病毒樣結構域突變后顯著降低。鑒于EWSR1、FUS和TAF15誘導相分離冷凝物的能力33,34以及它們的朊病毒樣結構域在其他肉瘤中建立DNA可及性和染色質活化中的關鍵作用21我們的研究表明,EWSR1-ATF1可能表現出類似的新形態先鋒特性,使CCS腫瘤啟動,包括選擇性地與SWI/SNF重塑復合物相互作用的能力。

我們進一步發現EWSR1-ATF1結合位點富含額外的TF基序,包括眾所周知的神經嵴調節因子TFAP2A和SOX10,并被黑素細胞發育和細胞色素沉著的主調節因子MITF共同占據。與這些因子的合作可能具有雙重功能,將它們募集到EWSR1-ATF1位點進行轉錄激活,并從其原始結合位點置換出來,以進一步改變腫瘤前體細胞的分化狀態。值得注意的是,這也適用于wt ATF1。ATF1以及相關的CREB和CREM蛋白的生理表達在鼠和人胚胎發育期間是必需的35,36,37,而ATF1表達和/或活性的增加與不同癌癥類型中腫瘤細胞存活、增殖和播散的增加相關(Chen M等,發表于,https://doi.org/10.1016/j.gendis.2021.04.008).與這一觀點一致,融合蛋白將wt ATF1募集到細胞型限制性遠端位點可能會改變其活性并有利于CCS的發展。雖然我們不能排除wt ATF1在某些情況下可能由于暴露CRE基序的染色質可及性增加而被間接募集到EWSR1-ATF1結合位點的可能性,但在EWSR1-ATF1缺失時觀察到的ATF1 N信號的減少表明了對EWSR1-ATF1結合的直接依賴性??紤]到這種bZIP家族的TFs的異二聚化能力,其他CRE基序結合TFs也可能與EWSR1-ATF1協同作用并調節其活性。

TFAP2、SOX10和MITF參與了NC誘導、譜系分化和終末分化的早期步驟27,它們表達的改變與NC衍生腫瘤的轉移行為相關38,39以及其他癌癥。例如,在MM中,ATF1和SOX10的增加,與TFAP2A表達的喪失相關,通過以相反的方式調節許多參與細胞粘附、細胞外基質重塑和細胞存活的基因,驅動腫瘤生長和轉移38,39。鑒于EWSR1-ATF1的組成型活性,推測CCS中融合蛋白的表達,結合TFAP2A、SOX10和MITF的基因組重定位,可能維持模擬MM進展的侵襲性表型是很有吸引力的。這一觀點得到了CCS在肉瘤中淋巴結轉移率最高的觀察結果的支持40大多數傾向于通過血源性途徑傳播。TFAP2A和MITF也起到把關者的作用,控制細胞增殖和分化之間的平衡,這是兩個典型的相互排斥的過程41,42,43。一種可能的情況是,在CCS中,EWSR1-ATF1與額外的TF的協同結合可能會使平衡傾向于兩個過程中的一個,而EWSR1-ATF1的缺失會導致相反的效果。因此,在這項研究中鑒定的協同TF網絡可能服務于EWSR1-ATF1,誘導腫瘤發展所需的致癌重編程。

我們研究中的一個相關發現是EWSR1-ATF1缺失后3D相互作用的顯著變化,盡管融合蛋白的結合位點相對有限。重要的是,這些變化包括染色質環的獲得和丟失,表明順式連接性的這些變化可能是由EWSR1-ATF1直接轉錄靶的減少和分化基因的增加共同導致的。獲得深刻影響染色質相互作用的能力甚至可能代表肉瘤促進融合蛋白(如EWSR1-FLI1和EWSR1-ATF1)的潛在關鍵特征,這提供了許可致癌程序和分化狀態的建立。

我們的研究強調了將染色質活性和連接性的變化與原代單細胞表達譜相結合的力量,以揭示定義腫瘤和祖細胞身份的分化狀態。在CCS中,基因工程小鼠模型表明MSCs和NCSCs對EWSR1-ATF1驅動的轉化特別寬容9,10。最近,CCS起源細胞被認為是一種神經干細胞衍生的外周神經細胞,表達神經干細胞。基因,參與髓鞘生成,通常限于SchC8。雖然這些結果與人類CCS中SchC標記的表達一致,但在同一項研究中,終末分化的SchC和黑素細胞中的EWSR1-ATF1表達未能產生腫瘤,這表明CCS可能源于分化較低的神經嵴衍生物,并且SchC相關的表型可能由融合蛋白賦予。

與這些觀察結果一致,我們對EWSR1-ATF1缺失的CCS細胞中從頭誘導的轉錄信號的功能分析顯示,在與神經嵴分化和染色質調節相關的方面有很強的富集。有趣的是,在我們發現的誘導基因中TFAP2A, SOX10, 小眼畸形相關轉錄因子, 戰神蒂爾髓磷脂堿性蛋白,所有這些都參與NC衍生物的終末黑素細胞分化,SOX10和TFAP2A是誘導MITF表達所必需的43. 髓磷脂堿性蛋白髓鞘形成基因在SchC終末分化過程中上調,在與神經組織再生相關的SchC重編程過程中被抑制44。盡管不是從頭增強劑的直接目標,也在CCS腫瘤細胞中EWSR1-ATF1缺失時上調。因為該基因以前被鑒定為CCS前體細胞的標志,可以想象這些腫瘤的起源細胞位于SchC前體細胞和黑素細胞之間的分化路徑上,其軌跡因EWSR1-ATF1誘導的拓撲和轉錄變化而改變。自從SchC和骨髓來源的MSC的子集被提議共享一個共同的NCSC來源45很容易推測,它們相似的發育個體發生是它們允許EWSR1-ATF1驅動的轉化,以及在多個不同解剖位置(包括骨)出現EWSR1-ATF1相關腫瘤的基礎。與這一假設相一致的是,我們發現在人類細胞圖譜(HCA)的皮膚數據集中,分化的黑素細胞和SchC的單細胞譜中富含我們的157個從頭基因簽名,該圖譜包括超過160,000個初級單細胞分析32。相比之下,EWSR1-ATF1直接靶基因在SchC譜中僅中度富集。值得注意的是,融合蛋白丟失后SU-CCS-1細胞中黑素體的數量顯著增加,證實了這些細胞中終末黑素細胞分化的誘導。綜上所述,這些結果表明,CCS前體細胞在EWSR1-ATF1缺失后仍具有沿黑素細胞和SchC譜系分化的可塑性。

連同它們潛在的共同來源于NC衍生物,我們的研究為MM和CCS之間的生物學相似性提供了進一步的分子洞察。MM是最致命的癌癥形式之一,主要是由于其高轉移潛能。其侵襲和轉移表型的獲得與細胞去分化和劫持作為NCSCs特征的發育程序有關46。最近,MM對BRAF和MEK聯合抑制劑的耐藥機制也與顯示NSCS特性的腫瘤細胞短暫群體的出現有關,證實了非遺傳驅動因素在這些腫瘤中藥物耐受性的重要性47。類似地,EWSR1-ATF1誘導的去分化狀態可能促進CCS對常規治療的內在抵抗,這仍然是有效治療的主要障礙??紤]到這種重編程過程可能由SOX10、TFAP2A和MITF到EWSR1-ATF1結合位點的基因組重定靶來驅動,重定這些TF的靶以誘導黑素細胞表型可能構成有效的治療策略,允許腫瘤細胞分化并變得更加化學敏感和可能具有免疫原性。

有趣的是,我們關于AFH染色質和表達譜的數據表明,這些腫瘤來自不同的前體細胞,盡管具有相同的致癌驅動事件。為了支持這一觀點,EWSR1-CREB1和EWSR1-ATF1在未分化的人ESCs中的表達導致基因表達信號分別重現AFH和GI-CCS,而EWSR1-ATF1在ESCs衍生的MSCs中的表達誘導CCS黑素細胞標記SOX10、PMEL和SLC7A548.

總的來說,我們的觀察得出了EWSR1-ATF1相關腫瘤中細胞組織發生和分子表型之間的聯系。他們還提出,這些腫瘤的分化可以被調節,以達到對當前療法更敏感的細胞狀態。然而,不同的表型可以在同一腫瘤樣品的細胞亞群中共存,并且它們的侵襲性可以至少部分地通過融合蛋白及其協同TFs的不同表達水平來確定,正如最近報道的EWSR1-FLI1在尤文肉瘤中的作用49。這個假設可以通過原發性腫瘤的單細胞表達譜來解釋??傊?,盡管罕見,CCS可以提供一個有價值的模型來解釋細胞分化與腫瘤發展和其他癌癥類型的治療耐藥性之間的分子基礎。特別是,此處描述的CCS和MM之間值得注意的相似性可能為鑒定新的分化療法鋪平道路,使這兩種腫瘤以及其他EWSR1-ATF1相關疾病對可用的療法更加敏感。


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