用于低氧腫瘤光活性治療的鋨-過氧化物絡合物

對缺氧和難治性實體腫瘤的有限治療效果阻礙了光動力療法的實際應用。在此，我們報告了我們對鋨-過氧化物絡合物(Os2)，它在黑暗中不活躍，但能釋放一個過氧配體O₂^??即使在沒有氧氣的情況下，在光照射下也會轉化成細胞毒性鋨絡合物(Os1). Os1在低氧腫瘤中存在或不存在輻射時具有細胞毒性，表現為化療藥物。同時，光激活的Os2誘導活癌細胞內源性1，4-二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸光催化氧化，導致鐵下垂，由谷胱甘肽降解、脂質過氧化物積累和谷胱甘肽過氧化物酶4下調介導。體內研究已經證實Os2能有效抑制小鼠實體缺氧腫瘤的生長。提出了用金屬基藥物治療低氧腫瘤的有前途的策略。

由細胞異常增殖和血管化引起的實體腫瘤缺氧微環境會極大地損害傳統光動力療法(PDT)的治療效果¹，這通常需要O₂為了在光敏劑的光活化下產生活性氧(ROS)^{2,3,4,5,6,7,8,9}。最近已經引入了許多創新的方法來解決腫瘤缺氧的問題。一些添加劑，如全氟化碳、人造紅細胞和共價有機框架^10,11,12，進位O₂其他的利用腫瘤微環境獨特的原位特征來產生O₂。其中就有曹₂和石墨相-氮化碳(gC₃N₄)碳化^13,14或者高H₂O₂MnO在腫瘤細胞中的濃度₂或者H₂O₂分解^15,16或者甚至是由光合細菌產生的光催化氧氣¹⁷。然而，這些納米材料藥物仍然不理想，并且有許多可能的副作用¹⁸。此外，體內研究表明，O₂促進惡性細胞的增殖并抑制其凋亡，這些結果不利于PDT¹⁹。因此，提高對低氧腫瘤的光療效果是必要的。

據報道，一些金屬配合物對低氧腫瘤表現出優異的PDT效應^{20,21,22,23,24,25,26}。它們中的大多數不通過傳統的用于PDT的II型機制依賴于氧。例如，Sadler等人研究了銥(III)光氧化還原催化可以提供不依賴于氧的作用機制來對抗低氧腫瘤。銥(III)配合物光催化氧化活細胞中重要的輔酶1，4-二肼屈煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH ),產生具有高轉換頻率的NAD自由基，并在缺氧條件下協同光還原細胞色素C²⁰。Chao等人設計了一種銥(III)配合物，該配合物在缺氧條件下照射后產生游離碳自由基²⁶。此外，光活性化療(PACT)有可能克服缺氧帶來的限制。在PACT中，金屬絡合物可以以受控的方式被光活化以產生細胞毒性物質。有毒氣體，如NO²⁷和一氧化碳²⁸或以配體為中心的細胞毒性物質總是可以通過光活化來釋放^29,30,31,32。超氧自由基(O₂^??)是毒性最大的ROS之一，并且已經被確定為用于癌癥治療的最有用的氧化劑和協同化療中的佐劑^33,34。在細胞內超氧化物歧化酶的作用下₂^??可以形成H₂O₂還有O_2.累積的H₂O₂進一步轉化為羥基自由基(OH ),具有增強的毒性和反應性，加劇癌細胞的氧化損傷，提高抗癌效果³⁵。不依賴于O的光活性化合物的設計₂但光控釋放活性氧在低氧腫瘤治療中有重要的應用前景。

在這項工作中，我們研究了鋨-過氧配合物(Os2)，它的結構在黑暗中很穩定。然而，在用465 nm光進行光活化時，Os2釋放O₂^??即使在嚴重缺氧的條件下(1% O₂)，并轉化為細胞毒性Os1在Cl中^?含有PBS溶劑(圖。1a)，從而在缺氧狀態下保持有用的光活化功效。Os1在光和暗下都顯示毒性，有助于化療和PACT的協同作用Os2在光照下。我們還發現輻射Os2誘導由GSH降解、脂質過氧化物積累和GPX4下調介導的明顯的鐵下垂。此外，Os2可以光催化氧化活癌細胞中的內源性NADH，引發瞼下垂。體內研究證實Os2有效抑制小鼠實體缺氧腫瘤的生長。因此，這項工作正在開發一種釋放氧氣的方法₂^??用于通過鐵下垂機制治療缺氧腫瘤細胞。

a光介導示意圖Os2O的釋放₂^??和Os1. b的紫外-可見吸收光譜Os2(100微米)在PBS溶液(pH = 7.4，1% DMSO)中，光照(465 nm，13 mW/cm²)在298 K。c高效液相色譜法分析Os2(10微米)在PBS溶液(1% DMSO)中，在黑暗中或照射60分鐘后。流動相是CH₃CN和水(體積比1:1)。

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光活化性能

鋨-過氧配合物的合成Os2是基于我們之前報道的方法³⁶，表征數據可以在支持信息中找到(SI，實驗部分和補充圖。1–3). Os2在室溫(rt)下的黑暗中，在pH = 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中高度穩定(補充圖。4).然而，在465 nm光照射下，溶液Os2經歷從棕色到淺粉色的漸變(圖。1binsets)，這讓我們對這種轉換進行了詳細的研究。對光解產物進行了高分辨率質譜(HRMS)測量，并在以下位置觀察到一個主峰m/z= 1175.2351(補充圖5).這個離子的質量和同位素分布與Os1。的形成Os1被HPLC分析進一步證實。如圖所示。1c新峰的保留時間與獨立合成的保留時間一致Os1(補充圖6–10，表格S1–S2。關于的合成和表征也可參見SIOs1).此外，輻照60分鐘后，轉化率為77.45%Os2到Os1證明了Os1是主要的光產物(圖。1c)，轉化率為0.46 μm ol·L^?1部^?1基于以下物質在459納米處的吸光度變化Os2(圖。1b和補充圖。11).

溶液中的活性氧檢測

由于氧的離解₂從金屬中心的單位Os2在光照下，我們試圖驗證O₂單位以超氧陰離子(O₂^??).我們首先試圖檢測O₂^??通過使用非熒光二氫羅丹明123 (DHR123)探針²⁴，它能與O反應₂^??并在526 nm附近發射強綠色熒光。如圖所示。2a，當在465納米(13毫瓦/厘米²)，的解決方案Os2顯示出不斷增加的排放，表明O₂^??。我們還模擬了芬頓反應過程³⁷。當...的時候Os2(15微米)和少量超氧化物歧化酶(SOD)加入到含有鐵的PBS溶液中²⁺亞甲藍(MB)探針(MB，5 μg/mL)在665 nm處的吸光度下降，降解率為70.26%(補充圖。12).相反，在對照實驗中只使用Os2和Os2+ SOD時，MB的特征紫外-可見吸收帶沒有發生變化?；谶@些發現和已發表的數據，我們提出的機制在圖。2f。在SOD酶的作用下，O₂^??不成比例地產生H₂O₂還有O₂。OH由H產生₂O₂在Fe的作用下²⁺，然后與MB反應，從而減少其吸收。這些發現證實了Os2能產生O₂^??在光照下。

a監測O的發射光譜₂^??生成者Os2(10微米)使用DHR123探頭(10微米，λ_不包括= 488納米)。b氧的ESR信號₂^??在常氧中光照后被DMPO (18 mM)捕獲。c的ESR信號¹O₂在常氧光照后被TEMP (8 mM)捕獲。dABDA (100微米)的紫外-可見吸收光譜用于監測¹O₂由...產生Os2(20微米)在常氧光照下。e的情節₀-ABDA在378 nm處的λ與照射時間的關系Os1或者Os2在缺氧或常氧狀態下(n= 3個獨立實驗)。誤差線代表平均值的標準差。f生成O的示意圖₂^??, ¹O₂哦，通過光激活Os2。光照:465納米，13毫瓦/厘米²；實驗溫度:298K；超氧化物歧化酶。

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為了更深入地了解ROS的本質，我們使用5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和(2，2，6，6-四甲基哌啶)氧基作為自旋陷阱進行了電子自旋共振(ESR)測量。具體來說，DMPO被用來誘捕O₂^??由...產生Os2在465納米光照射下^37,38,39。在含有DMPO和Os2暴露于光照射下，DMPO-OOH的幾個信號峰出現在3480–3540G(圖2b)，這就解釋了O的產生₂^??。為了研究Os2生產¹O₂在光照下，我們用溫度來測量¹O₂產生^40,41。如圖所示。2c，在3480和3530 G之間觀察到強度為1:1:1的三線信號Os2將混合溶液在光照下升溫。在存在下觀察到類似的信號Os1(光的產物Os2).這些ESR結果表明Os2可以產生O₂^??和¹O₂在光照下。

此外，9，10-蒽二基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)進一步用于檢測¹O₂量子產率Os1和Os2在光照下。如圖所示。2d和補充圖。13隨著輻照時間的增加，ABDA在378 nm附近的特征吸收峰逐漸減小。這¹O₂量子產率Os1和Os2通過與Ru(bpy)比較，分別計算為0.039和0.04₃²⁺(補充圖13和桌子S3)⁴².

以上實驗均在有氧條件下進行。接下來，我們研究了缺氧(缺氧，氮氣脫氣)條件下ROS的產生。如補充圖所示。14，發射光譜顯示在存在下增強綠色熒光Os2和DHR123探針。這個結果證明了Os2也會產生O₂^??缺氧狀態下。我們進一步測量了¹O₂缺氧狀態下的世代。如補充圖所示。15，ABDA在兩者面前的吸收Os1和Os2缺氧條件下未能發生明顯變化，證實了no¹O₂在缺氧條件下產生。然而，ABDA的吸收率在以下情況下會降低Os2+ SOD。這是由于Os2生產O₂^??在缺氧的情況下₂^??不成比例地產生H₂O₂還有O₂在SOD酶的作用下，O₂可用于¹O₂光產物的產生Os1(圖。2f).然而，Os1在缺氧條件下不能產生ROS(補充圖。15).

我們之前的研究表明Os2在相對苛刻的條件下(80 ℃, K₂哥倫比亞₃純氧氣氛)，并根據實驗和理論結果提出了協同雙氫轉移機理，但催化反應在室溫下幾乎不進行³⁷。我們進一步驗證了Os2在細胞實驗之前的細胞環境中。結果表明，在298 K的黑暗中，它在Dulbecco的改良Eagle培養基(DMEM)細胞培養基中或在具有不同pH值的PBS溶液中高度穩定(補充圖。16和17).此外，治療Os2還原劑(NADH、GSH和Cys)或細胞氧化劑(如H₂O₂過氧化物酶、細胞色素p450)不會導致紫外-可見吸收光譜發生顯著變化(補充圖。18).補充圖19和20進一步證明了Os2不與活性氧反應，例如¹O₂。這些結果表明Os2在黑暗的細胞環境中是穩定的。

輻照下細胞活性氧的產生

我們研究了光誘導活性氧產生的能力Os2在活的HeLa細胞中。使用二氫乙錠(DHE)、羥苯基熒光素(HPF)和單線態氧傳感器綠(SOSG)作為探針來監測氧的產生₂^??，哦還有¹O₂，分別為^37,38。這些探針對各種自由基的檢測機制如圖所示。3a。共聚焦顯微鏡顯示，當Os2-孵育的HeLa細胞在常氧(20% O₂465納米，13毫瓦/厘米²1 h)，DHE染色細胞中的熒光信號顯著增強(圖。3b，c)。這證實了Os2釋放O₂^??在光照下的細胞中。缺氧狀態下(1% O₂)，光照后的熒光強度與常氧下獲得的相似，表明O₂^??從...產生Os2與O無關₂。這與O的機理不同₂依賴I型光動力機制。

因為我們知道O₂^??在細胞內超氧化物歧化酶和鐵的存在下能產生·OH²⁺離子³⁷，我們通過HPF染色進一步研究了細胞中OH的產生。共焦成像顯示Os2能在常氧或缺氧條件下在HeLa細胞中產生OH(圖。3b，c)。此外，我們還比較了¹O₂的產生Os2和光產物Os1通過使用SOSG探測器，發現在缺氧的情況下，Os2在生產上更有優勢¹O₂比Os1。結果表明，綠色熒光在Os2經處理的細胞在常氧和低氧下都是強壯的。然而，熒光在Os1低氧條件下處理的細胞比常氧條件下觀察到的細胞弱得多(補充圖。21).這些結果與圖2中的結果一致。2f，表明Os2首先誘導O的釋放₂^??和生產Os1，伴隨著O的形成₂(作為氧氣來源Os1)和OH通過芬頓反應。最后，¹O₂是由光產物產生的Os1，但很難確定是否Os2也可以生產¹O₂由于其轉換為Os1在465納米的光照下。這些數據都表明Os2可用作低氧腫瘤細胞光活化治療的有效藥物。

體外光毒性

的暗細胞和光細胞毒性Os2和Os1用MTT法測定抗HeLa細胞活性^40,41。如圖所示。4和桌子1, Os2在常氧和缺氧條件下具有低暗細胞毒性和高光細胞毒性(圖。4a，c)。集成電路₅₀)_黑暗僅用黑暗培養測定的值分別為89.2和> 100微米(表1).集成電路₅₀)_光的值Os2在常氧或低氧條件下通過光照射測定的，分別為1.23和5.86微米。缺氧條件下的光細胞毒性可以用氧的釋放來解釋₂^??經過Os2和光照射，接著產生O₂，可由輕質產品使用Os1來產生¹O₂和OH，通過芬頓反應產生更強的毒性。相反，輕質產品(Os1)在常氧和缺氧條件下顯示出高的暗細胞毒性和光細胞毒性(圖。4b，d)。集成電路₅₀)_黑暗的值Os1在常氧和低氧條件下分別為8.12和9.95微米₅₀)_光常氧和低氧條件下的值分別為1.31和7.51微米(表1).這個結果表明Os1具有高的光細胞毒性和暗細胞毒性，可被視為化療藥物。然而，在缺氧的情況下，由于缺氧，Os1沒有顯示出明顯的光動力效應。的圓周率值Os2(> 18)遠高于缺氧下的Os1 (1.3).

不同濃度硝酸甘油處理的HeLa細胞的存活率Os2或者Os1常氧下(20% O₂, a, b)或缺氧(1% O₂, c, d)在黑暗中或光照下。所有細胞生存力數據都是一式四份(n= 4個生物學上獨立的樣本)。誤差線代表平均值的標準差。用雙尾Student’s方法計算統計顯著性t測試(*p?<?0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).培養溫度:310 K。光照:465納米，13毫瓦/厘米²，1 h。

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順鉑和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)用作對照(表1).非常低的暗毒性和光毒性(兩者(IC₅₀)_黑暗和(集成電路₅₀)_光> 50微米)在5-ALA藥物暴露8小時和40小時恢復(與相同的條件Os2).順鉑具有一定的暗毒性(IC₅₀)_黑暗= 33.22微米)，其光毒性與暗毒性相比不明顯。我們進一步測量了細胞攝取Os2或順鉑對HeLa癌細胞的作用(補充圖22).結果表明，積累的Os2在細胞中的濃度低于順鉑。這導致較低的暗毒性Os2比順鉑，因此Os2是一種可行的藥物，在黑暗中比順鉑能減少毒副作用。然而，光毒性的Os2比順鉑在輻射下的高得多(表1).

鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(鈣黃綠素-AM)或碘化丙錠(PI)染色也用于區分活細胞(綠色)和死細胞(紅色)。如補充圖所示。23，黑暗集團的Os2在常氧和缺氧時顯示強烈的綠色熒光(活細胞)而沒有紅色熒光(死細胞)，而對照組在黑暗或光照下也沒有顯示死細胞。相比之下，輕組的Os2顯示微弱的綠色熒光和強烈的紅色熒光，表明Os2導致光照下細胞大量死亡。

瞼下垂機制

據報道，ROS產生的光化學過程可導致癌細胞的鐵下垂^6,43,44。這讓我們考慮是否Os2會誘發瞼下垂。谷胱甘肽與瞼下垂密切相關^45,46我們首先發現了Os2來消耗谷胱甘肽。如圖所示。5一，b隨著光照時間的增加，412 nm處的吸收降低，表明Os2當受到輻射時，會消耗谷胱甘肽。我們測定了細胞中的谷胱甘肽水平Os2，發現輻照組的GSH水平明顯低于非輻照組(圖。5c).因此，我們得出結論Os2在輻射條件下可以消耗細胞GSH。

a與輻照時間相關的谷胱甘肽(200微米)損耗Os2(20微米)在298 K的藍光照射下b隨著照射時間的增加，412 nm處的吸收降低。c不同處理后細胞內的谷胱甘肽水平。所有實驗都是一式三份重復進行(n= 3個生物學上獨立的樣本，p價值觀(p):10微米-0.000025，20微米-0.00065)。dC11-BODIPY探針(30微米，310 K，0.5 h)檢測的處理細胞中脂質過氧化物的熒光圖像。C11-BODIPY: λ_不包括= 488納米，λ_全身長的= 570±50納米。e從中的圖像計算的平均熒光強度d。該實驗獨立重復三次，結果相似，p= 0.000024.f蛋白印跡分析GPX4在HeLa細胞中的作用Os2(20微米，310 K，8 h)進行或不進行光處理。RSL3是陽性對照組。gGPX4的相對表達水平計算自f所有實驗都是一式三份重復進行(n= 3個生物學上獨立的樣本，p= 0.000025).誤差線代表平均值的標準差。用雙尾Student’s方法計算統計顯著性t測試(*p?<?0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).h這種光活性抗腫瘤療法中的鐵下垂過程。光照:465納米，13毫瓦/厘米²。GSH谷胱甘肽，Fer-1鐵抑制素-1，GPX4谷胱甘肽過氧化物酶4。

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鐵下垂是一種由過度脂質過氧化引起的鐵依賴性細胞死亡。瞼下垂的主要特征是細胞抗氧化能力失活后，含有多不飽和脂肪酸的磷脂在細胞膜上被過氧化，破壞細胞膜，導致瞼下垂^47,48,49?？寡趸瘎┕入赘孰倪^氧化物酶4 (GPX4)以谷胱甘肽依賴的方式特異性催化脂質過氧化物中氧化活性的喪失^50,51，隨后對GPX4的抑制誘導了瞼下垂癥。GSH的消耗可以間接抑制GPX4的表達。我們推測Os2可以進一步抑制GPX4的表達，我們通過對GPX4的western blot分析驗證了這一假設。如圖所示。5f–g，Os2在黑暗中不能減少GPX4的表達。然而，在光照下，Os2顯著降低GPX4的表達，ROS引起的GSH消耗和對GPX4的抑制會進一步導致脂質過氧化物的積累，誘發瞼下垂。我們使用C11-BODIPY作為脂質過氧化物探針，用于監測脂質過氧化物的細胞內積累(圖。5d，e)。共聚焦顯微鏡顯示，用Os2在暴露于光后顯著增強，表明脂質過氧化物的顯著積累，這可以被鐵抑制素-1(一種鐵下垂抑制劑Fer-1)有效抑制。所有上述結果證實Os2誘發瞼下垂，如圖。5h.

NADH光催化氧化

作為一種輔因子，1，4-二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)調節細胞線粒體的氧化還原平衡，在調節能量產生中起重要作用。如果NADH被氧化成NAD⁺，它可以破壞整個呼吸鏈，殺死細胞^19,52,53。我們研究了NADH是否能被Os2在光照射下，可以提供光催化氧化途徑來殺死癌細胞。的光催化效率Os2(20微米)向NADH (175微米)的遷移首先由紫外-可見吸收光譜測定。如圖所示。6a隨著照射時間的增加，339 nm處的吸光度逐漸減小，259 nm處的吸光度逐漸增大。相比之下，非照明的吸收Os2組無明顯變化(補充圖。24).這表明Os2在光照下能降低NADH的酶活性。我們還計算了NADH氧化轉化數(噸)Os2以評估其光催化效率。NADH氧化的TON值Os2在光照射下為3.888，比未照射組高30倍(噸_黑暗= 0.137)(圖。6b).同樣的，Os1也顯示了對NADH類似的光催化氧化作用(補充圖。25).

a的反應Os2(20微米)和NADH (175微米)在PBS溶液中，在藍光照射下，通過298 K下的紫外-可見吸收光譜監測b一噸Os2在黑暗或輻射條件下(n= 3個獨立實驗，p= 0.0000016).cNADH (3.5 mM)的光催化氧化Os2(0.25毫米)在黑暗或輻射條件下，由以下人員監控¹298 K時的核磁共振波譜。與藍色三角形相關的峰代表NADH，那些帶有紅色正方形的峰代表NAD⁺. d經處理的HeLa細胞中的NADH濃度。Os2: 20微米，310 K，8小時。所有的實驗都是一式三份重復進行(n= 3個生物學上獨立的樣本，p= 0.000039).誤差線代表平均值的標準差。用雙尾Student’s方法計算統計顯著性t測試(*p?<?0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).e光催化氧化NADH的示意圖Os2隨后是誘導性瞼下垂。光照:465納米，13毫瓦/厘米²。噸周轉數、NADH 1，4-二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、GSH谷胱甘肽；GSSG氧化型谷胱甘肽，GPX4谷胱甘肽過氧化物酶4，GR谷胱甘肽還原酶。

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NADH的光催化氧化也通過¹核磁共振氫譜₂O/CD₃298 K時的外徑(1/3，v/v)。6c，在Os2和NADH照亮的基團，來自NAD的煙酰胺環上的氫的新峰⁺在6.13、8.31、8.55、8.99、9.36和9.58處觀察到，但沒有新的NAD⁺在未照射組或未照射組中觀察到峰值Os2團體。直覺上，這表明Os2可以在光照下氧化NADH，將其轉化為NAD⁺。隨后，我們使用NAD/NADH-Glo在細胞水平上測量了NADH光催化氧化率^銩方法，這是一種用于檢測NAD的生物發光方法⁺還有NADH。如圖所示。6d，化學發光強度Os2——輕組被證明低于其他組。這些結果表明Os2可以通過光照射在細胞水平上有效氧化NADH，從而殺死癌細胞。從圖中可以看出。6e，NADH不僅可以轉化為NAD⁺通過與Os1交互^*(的興奮狀態Os1)，但也可被氧化成NAD⁺由O₂^??從...發布Os2。NADH的下調間接有助于谷胱甘肽還原酶將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原為谷胱甘肽⁵⁴，導致脂質過氧化物的積累，最終實現協同誘導瞼下垂。

體內光活性抗腫瘤療法

我們通過Os2研究了體內光活化治療的可行性。由于Os2是一種小分子，并且沒有特定的靶向基團，因此可以通過腫瘤內給藥(圖。7a).如圖所示。7b，與其他三組相比，用Os2-light處理的小鼠的腫瘤生長受到抑制。Os2-光組的腫瘤大小在四組中最小(圖。7d)，并且Os2-光組的平均腫瘤重量顯著低于其他組(圖。7c).收集最終治療后的腫瘤組織用于組織學評估。蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示在Os2-光組中腫瘤組織明顯破壞，而在其他三組中腫瘤組織未受影響(圖。7e).

a體內(荷HeLa腫瘤的Balb/c小鼠)治療方案示意圖。用光(465納米，13毫瓦/厘米²)靜脈注射25 μL含500微米Os2的PBS后60分鐘。b治療后腫瘤生長曲線。誤差棒是基于每組五只小鼠的標準誤差(SD)。用雙尾Student’s方法計算統計顯著性t測試，p= 0.0004 (*p?<?0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).c各種治療后第16天小鼠的腫瘤重量。誤差棒是基于每組五只小鼠的標準誤差(SD)。用雙尾Student’s方法計算統計顯著性t測試，p= 0.00042 (*p?<?0.05, **p≤ 0.01或***p≤ 0.001).d各種處理后代表性小鼠的數碼照片。e不同處理后小鼠HeLa腫瘤組織的H&E染色圖像。這個實驗獨立地重復了三次，結果相似。

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為了評價Os2的生物安全性，我們首先分析了靜脈注射三倍治療劑量(2.69毫克/千克)的健康小鼠的主要器官的H&E染色切片^?1).結果顯示在這些切片中沒有明顯的組織損傷(補充圖。26).我們還使用斑馬魚來測試Os2的生物安全性(補充圖。27)與通常用作生物標記的綠色熒光蛋白(GFP)一起將生理過程可視化。在與Os2孵育5天后，斑馬魚的血管明顯沒有受損，顯示出良好的體內生物相容性。