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血管周腱生蛋白C觸發巨噬細胞和內皮細胞的順序激活,在肺中產生促轉移血管小生境

 二維碼
發表時間:2022-04-28 12:21作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

擴散的癌細胞經常寄居在次級器官的脈管系統附近。然而,我們對血管周圍部位引起的細胞串擾的理解仍然是初步的。在這里,我們確定了在乳腺癌肺部定植期間,控制促轉移血管小生境形成的細胞間機制。我們發現,在轉移相關內皮細胞(ECs)中誘導的特定分泌因子通過增強干細胞特性和癌細胞的生存力來促進小鼠的轉移。通過tenascin C (TNC)刺激Toll樣受體4 (TLR4)激活的血管周巨噬細胞,通過分泌一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子(TNF)誘導EC介導的小生境成分的產生,在小生境激活中起關鍵作用。值得注意的是,這種機制不依賴于血管內皮生長因子(VEGF),它是內皮細胞行為和血管生成的關鍵調節因子。然而,靶向巨噬細胞介導的血管小生境激活和VEGF調節的血管生成導致抑制小鼠肺轉移的能力增加??傊?,我們的發現為轉移瘤中血管龕的形成提供了機制上的見解。

主要的

當癌癥發展到轉移時,微環境中播散的癌細胞和非轉化細胞之間的相互作用起著重要的作用1。播散的癌細胞和次級器官的基質細胞之間的串擾可導致促進惡性生長的轉移小生境的產生2,3。內皮細胞在原發性腫瘤和轉移瘤的基質中經常是顯著的;它們形成脈管系統的內層細胞,例如通過向腫瘤輸送營養和其他必需物質而對癌癥生長至關重要的血管4。血管內皮生長因子是血管生成的主要促進劑,通過誘導內皮細胞增殖、遷移和存活,從已有血管形成新血管5。這可以通過激活已建立的血管的尖端細胞而導致血管滲透性增加和發芽4。最近的發現表明,血管可以對轉移進展產生實質性影響,這種影響超出了營養輸送6。研究表明,播散的癌細胞與轉移部位的脈管系統相關,并表明增強的粘附和與ECs的相互作用調節轉移中癌細胞的表型和功能7,8,9.

在這項研究中,我們分析了乳腺癌細胞和肺中內皮細胞在轉移過程中的相互作用。我們確定了促轉移血管小生境的成分,它們不依賴于VEGF信號傳導,支持干細胞特性和播散癌細胞的存活。探索血管生態位形成的調控機制,我們發現它不是由癌細胞直接誘導的,而是需要轉移相關的巨噬細胞作為中間體。血管周巨噬細胞被細胞外基質蛋白TNC通過TLR4激活,通過分泌NO和TNF誘導內皮細胞表達小生境成分來促進血管小生境的形成。該結果揭示了血管小生境中的關鍵串擾,并強調了細胞外基質蛋白作為轉移中微環境調節劑的重要性。

結果

肺轉移灶中內皮細胞的分子重編程

為了研究轉移定居過程中內皮細胞的分子變化,我們從靜脈注射MDA231-LM2乳腺癌細胞(MDA-MB-231 (MDA231)細胞的高轉移衍生物)的小鼠肺中分離出內皮細胞10。從具有不同階段轉移的肺中純化ECs用于轉錄組研究(擴展數據圖。1a、b).在癌細胞注射后第1、2或3周對轉移結節中內皮標記CD31的分析揭示,盡管早期結節(第1或2周)在血管附近生長,但轉移結節中血管的存在主要是在較晚階段(第3周)觀察到的(圖。1a–c).內皮細胞的數量也與肺中癌細胞的數量相關,表明在生長的轉移灶中有活躍的內皮細胞增殖(圖。1d).

圖1:轉錄組分析鑒定了肺轉移建群期間反應性ECs的特征性變化。
figure 1

a免疫熒光圖像顯示了在靜脈注射MDA231-LM2乳腺癌細胞后的指定時間點,小鼠肺中肺ECs (CD31)與轉移性乳腺癌細胞(GFP)的關聯。比例尺,50 μm。虛線表示轉移灶的邊緣。b,來自的轉移結節的量化a具有模塊內ECsn= 72個結節(第1周),n= 76個結節(第2周)和n=對于每個時間點,分析來自四只小鼠的83個結節(第3周)。數據以平均值±標準差表示c在第1-3周,MDA231-LM2衍生的肺轉移結節的大小。每個肺至少分析16個結節;n=每組4只小鼠。d,MDA231-LM2癌細胞(左)和ECs(右)。數據顯示意味著標準差;n=每個時間點4只小鼠。P用單向方差分析和Dunnett多重比較檢驗確定數值。e,在MDA231-LM2衍生的轉移的不同階段從小鼠肺中分離EC的實驗設置,隨后進行轉錄組分析。fPC分析從健康肺(對照)或具有不同轉移階段的肺(如e). g使用增殖或炎癥相關信號對分離的內皮細胞進行GSEA。帶標稱的簽名P?<?0.05 and FDR?<?0.25 were considered significant. h,i,小提琴情節顯示z腫瘤血管生成和尖端細胞信號的評分分析11,12 (h)或患者不良結果基因簇13,14 (i),根據在指定時間點從轉移性肺中分離的內皮細胞的轉錄譜計算。P使用平均值確定數值z-未配對雙尾的每個簽名的分數t-測試;n=每組3個生物重復。j顯示癌細胞注射后第3周肺ECs中上調的58種分泌蛋白(GSP58)基因表達的熱圖。截止日志2(折疊變化(FC)) > 0.75,P?<?0.05, FDRq?<?0.25. k,GSEA圖顯示了根據無肺轉移存活率排序的乳腺癌人肺轉移樣品中GSP58的富集。NES,標準化濃縮分數。FDR由下式確定P通過隨機排列測試計算的值。

源數據

為了從有轉移的肺中純化ECs,我們使用熒光激活細胞分選(FACS)來排除表達造血、上皮、成纖維細胞或癌細胞標記物(CD45、CD11b、EpCAM、CD140a/b和綠色熒光蛋白(GFP))的細胞,并選擇表達內皮標記物CD31的細胞(圖。1e和擴展數據圖。1c).通過表達額外的內皮標記或其他基質細胞的獨特標記來確定所選群體的純度(擴展數據圖。1d).使用微陣列對分離的內皮細胞進行轉錄組分析。主成分分析(PCA)揭示了不同時間點基因表達變化的顯著模式。在第1周和第2周發生了某些變化,但是在兩個時間點之間沒有觀察到顯著的差異;然而,最顯著的變化發生在第3周,將這個時間點與其他時間點區分開來(圖。1f).進一步的分析,如基因集合富集分析(GSEA)、基因本體(GO)術語分析或z-評分分析顯示,在第3周,與細胞增殖或炎癥相關的基因信號顯著誘導(圖。第一代擴展數據圖。1e–g和補充表格1).與這些發現一致的是,血管生成活動11,12在第3周的ECs中得到促進,并且也觀察到了與通透性增加(REACTOME)相關的血管變化(圖。1h和擴展數據圖。1h).根據內皮細胞增殖和炎癥的變化,這些過程中涉及的轉錄因子或途徑的特定靶標在第3周上調(擴展數據圖。1i和補充表格2).為了說明這些內皮細胞功能在人類轉移瘤中的重要性,我們組裝了與增殖或炎癥相關的基因,這些基因在轉移瘤的內皮細胞中特別上調(補充表34).我們將這些特異性轉移相關的EC信號應用于來自解剖的人類轉移瘤的轉錄組數據集,觀察到這兩種信號都與伴有肺轉移的乳腺癌患者的不良預后相關(擴展數據圖。1j).此外,基因標記與不良臨床結果相關13,14在第3周在內皮細胞中被誘導,表明內皮細胞活化與轉移進展相關(圖。1i).著眼于細胞間通訊的介質,我們分析了細胞外蛋白(GO:0005576)在轉移相關的ECs中。我們發現分泌蛋白(GSP58)的58個基因發生了顯著變化,這些基因在第3周的ECs中被特別誘導(圖。1j和補充表格5).值得注意的是,GSEA或卡普蘭-邁耶分析表明,GSP58在轉移瘤中的高表達與乳腺癌患者的低無肺轉移生存率相關,這意味著肺內皮細胞可能通過這些分泌因子中的一些促進轉移(圖。1k和擴展數據圖。1k,l).

內皮細胞中GSP58的表達在很大程度上不依賴于VEGF信號

考慮到VEGF是內皮細胞生物學和血管生成的關鍵調節因子,我們研究了轉移相關內皮細胞的基因表達變化是否依賴于VEGF。我們用抗VEGF抗體(B20.4.1.1)治療轉移小鼠15或同種型IgG和分離的肺ECs用于轉錄組分析(圖。2a).肺內皮細胞中特定的VEGF靶基因被抑制,轉移肺中的血管生長顯著減少,表明VEGF信號傳導受到強烈抑制(擴展數據圖。2a,b).值得注意的是,基因標記與細胞增殖和血管生成有關16,17在抗VEGF治療小鼠的肺內皮細胞中也受到抑制(圖。2b–f和擴展數據圖。2c–e).然而,盡管VEGF信號和內皮細胞增殖受到抑制,與患者不良預后相關的基因簇并沒有受到抗VEGF治療的影響(圖。2g).重要的是,炎癥反應和GSP58通常也不受抗VEGF的影響,表明這是一種VEGF非依賴性調節(圖。2h,我).當我們分析用靶向VEGF受體2的抗體(抗VEGFR2,DC101)治療的小鼠的肺ECs時,觀察到一致的結果(擴展數據圖。2f).盡管抗VEGFR2治療抑制了肺ECs中VEGF靶基因的表達以及增殖和血管生成信號,但炎癥和不良結果基因簇或GSP58沒有受到顯著影響(擴展數據圖。2g–m).這些結果表明,盡管抗VEGF治療有效地抑制了轉移結節內的血管形成,但它并不抑制由脈管系統分泌的與患者不良預后相關的58種因子中的大多數的表達。

圖2:在轉移相關的內皮細胞中,抗VEGF治療抑制增殖,但不抑制炎癥反應或GSP58信號的誘導。
figure 2

a,抗VEGF治療轉移性肺結節小鼠的實驗綱要。將MDA231-LM2細胞靜脈注射入NSG小鼠,然后用抗VEGF抗體B20.4.1.1 (B20)或對照IgG重復治療3周。在第3周分離肺內皮細胞,并進行轉錄組分析。選擇通過體內生物發光成像測量的具有相當的肺轉移負荷的小鼠進行分析。b,抗VEGF治療抑制轉移相關內皮細胞的細胞功能信號(反應蛋白)概述。FDR < 0.05的簽名包含在百分比計算中。c基因簇的GSEA:細胞周期有絲分裂(反應組)、DNA復制(反應組)、發芽血管生成(MSigDB中的C5收集)和tip細胞標記12B20處理后肺內皮細胞與對照IgG的比較。FDR由下式確定P通過隨機排列測試計算的值。d,e,小提琴情節顯示z-來自與轉移相關的肺EC增殖標記的基因分數(補充表3) (d)和腫瘤血管生成起簇16 (e)在來自對照(ctrl)或轉移(met)的純化肺ECs中表達。)-具有指定治療的小鼠。f基于GSEA,與IgG對照相比,B20處理的轉移相關內皮細胞中基因標記下調。顯示FDR < 0.25的簽名。藍色,與擴散相關的簽名;紅色,VEGF靶基因的標記;灰色,其他。gi間質不良結局聚類的小提琴圖分析13 (g左)和與預后不良相關的血管生成基因14 (g,對);與轉移相關的肺EC炎癥信號(補充表4) (h)和GSP58(i)在所示條件下以來自小鼠肺的ECs表達。在…里d,egi, P數值由平均值確定z-用Dunnett多重比較試驗通過單向ANOVA對簽名內的基因評分;n=每組3只小鼠。NS,不顯著。

源數據

內皮細胞表達促進轉移的分泌因子的基因

為了從GSP58中鑒別出與其他基質細胞相比ECs作為主要細胞來源的候選基因,我們研究了那些在信號中誘導程度最高的基因。選擇GSP58中誘導3.5倍或更多的所有VEGF非依賴性基因進行進一步分析,并在從小鼠肺轉移瘤中分離的四種不同基質細胞類型中測定它們的表達(圖。3a和擴展數據圖。3a).在肺內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞和上皮細胞中的表達分析顯示,四個基因——即抑制素亞基βB(Inhbb),層粘連蛋白亞單位α1(Lama1),分泌珠蛋白家族3A成員1(Scgb3a1)和TNF受體超家族成員11b,也稱為骨保護素(氧基聚明膠)—與其他細胞類型相比,在ECs中明顯表達(圖。3a和擴展數據圖。3b).

圖3:反應性內皮細胞產生的分泌因子促進肺轉移。

a,分析從轉移性肺分離的不同基質細胞中的內皮小生境候選基因。熱圖用對數總結了基因的表達2FC > 3.5。Z從每組三或四只小鼠中分離的不同基質細胞的qPCR分析計算得分。在內皮細胞中高表達的基因用紅色標記。BMDC,骨髓來源細胞;纖維。,成纖維細胞;腎上腺素。,上皮細胞。b四個內皮小生境候選基因在分離自具有不同乳腺癌細胞系轉移的指示小鼠品系的肺內皮細胞中的表達。熱圖由qPCR分析生成,并P由不成對的單尾計算的值t-測試。*P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001; n=每組3–4只小鼠。c四個候選基因表達的相關性分析CDH5在乳腺癌患者的轉移病灶中(GSE14020)。皮爾遜相關線性回歸(r)和雙尾P顯示值;n= 65.d乳腺癌患者肺轉移樣品中CD31、SCGB3A1和LAMA1表達的免疫組織化學分析;顯示了來自11名患者的分析的兩個轉移的代表性例子。箭頭表示陽性染色的內皮細胞。比例尺,100微米(患者1)和60微米(患者2)。e,表達SCGB3A1或LAMA1的肺轉移樣本的比例。fh肺的轉移集群(f)被SUM159乳腺癌細胞(g)和MDA231細胞(h)過表達內皮小生境因子或對照載體。g,h靜脈注射SUM159后42天的生物發光圖像(左)和標準化光子通量(右)g)和MDA231(h)乳腺癌細胞。S3A1,SCGB3A1。方框用上下四分位數描繪中間值。數據點顯示生物復制的值,觸須顯示最小值和最大值。g, P數值通過單尾Mann-Whitney檢驗進行計算。*P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001,?P= 0.069.控制,n= 20;INHBB,n= 6;LAMA1,n= 8;SCGB3A1,n= 5;OPG,n= 5.h,控制,n= 19;INHBB,n= 10;LAMA1,n= 4;SCGB3A1,n= 10;OPG;n= 9;四個基因,n= 5.i以人波形蛋白在小鼠肺中的表達為標志的轉移瘤的組織學實例h。所示為至少四個獨立樣本的代表。比例尺,200 μmj,Kaplan–Meier對er已編譯數據集的分析乳腺癌(KM繪圖儀)檢測四種內皮小生境因子與無復發生存率的關系(n= 347名患者)和總存活率(n= 79名患者)。P數值由對數秩檢驗確定。HR,危險比。

源數據

INHBB是TGF-β家族成員中激活素和抑制素的蛋白質亞單位,其中激活素已被證明可調節傷口愈合、纖維化和癌癥18. LAMA1編碼層粘連蛋白三聚體LN111和LN121的α鏈,在胚胎發育過程中廣泛表達,但在成人組織中更受限制19。值得注意的是,LN111是某些基底膜的成分。SCGB3A1是小分泌分子分泌珠蛋白家族的成員,在正常肺中表達,但其功能知之甚少20。OPG是TNF受體超家族的一員,通常被認為具有多效性功能,但其最典型的作用是充當TRAIL或RANKL的誘餌受體21.

我們觀察到一致的誘導Inhbb, Lama1, Scgb3a1氧基聚明膠在來自兩個異種移植模型(MDA231-LM2/SUM159-LM1)和兩個肺轉移的同系小鼠模型(4T1/E0771)的肺ECs中,證實了ECs中的表達不受抗VEGF治療的影響(圖。3b和擴展數據圖。3c,d).與來自具有肺轉移的小鼠的肺ECs相比,這四種候選物在4T1或E0771癌細胞中不顯著表達(擴展數據圖。3e).為了在完整轉移過程的背景下研究這些基因,我們分析了來自乳腺自發性轉移小鼠肺的內皮細胞,并觀察到所有四個候選基因的上調(擴展數據圖。3f,g).這種上調與轉移瘤的生長相關,并且在早期時間點無法檢測到,即使原發性腫瘤明顯生長。值得注意的是,轉移相關內皮細胞因子的誘導不受原發腫瘤切除的影響。3f,g).為了檢測小生境候選物的蛋白質水平,我們對來自轉移性肺的分選的內皮細胞進行了酶聯免疫吸附測定(ELISA)或酶免疫測定(EIA ),并揭示了所有四種蛋白質的顯著上調(擴展數據圖。4a、b).為了確定這些候選小生境與人類轉移的相關性,我們分析了乳腺癌患者肺轉移的樣本。在這些樣本中,四個候選基因的表達與內皮標記顯著相關CDH5(VE-鈣粘蛋白)(圖。3c).我們還使用免疫組織化學在來自11個人轉移樣本的組織切片上分析了SCGB3A1和LAMA1的表達,并觀察到8/11個樣本(73%)中SCGB3A1的EC表達和11/11個樣本(100%)中LAMA1的EC表達(圖。3d,e和補充表格6).這鼓勵我們研究四個候選基因在轉移中的功能,因此我們異位表達了它們INHBB, LAMA1, SCGB3A1和OPG分別注射到人類乳腺癌細胞中,然后通過靜脈注射到NSG小鼠體內。我們在SUM159和MDA231癌細胞(分別是SUM159-LM1和MDA231-LM2的親代細胞系)中表達了這些基因,并觀察到所有四個候選基因都單獨促進了肺的轉移定殖(圖。3f–I和擴展數據圖。4c–e).此外,四種基因在MDA231癌細胞中的聯合表達顯示了肺轉移生長的附加誘導(圖。3h,我).這表明,作為單獨的基因,INHBB, LAMA1, SCGB3A1氧基聚明膠確實可以促進轉移定殖,且這四種基因共表達可以為癌細胞提供進一步的優勢。結果表明,由這四個基因編碼的蛋白質是促轉移血管小生境的功能成分。

被診斷為轉移性復發的乳腺癌患者經常出現能夠相互播散的多發性轉移,并且已經在肺和肝之間觀察到這種器官間播散22。這激發了我們分析晚期肺轉移小鼠潛在肝轉移的興趣。具有肺轉移的小鼠的生物發光分析揭示了肝臟的定居(擴展數據圖。4f).我們從具有高生物發光的肝臟區域中分離出內皮細胞,并觀察到Inhbb, Lama1, Scgb3a1氧基聚明膠在與肝轉移相關的內皮細胞中高表達。第四代移動通信技術).重要的是,血管小生境因子的異位表達促進了肝臟的轉移。4h).這表明這四種小生境成分的功能作用超出了肺轉移和其他轉移部位,如肝臟。

最后,為了解決血管小生境與臨床結果的潛在聯系,我們使用雌激素受體(er)陰性乳腺癌樣本中四種血管小生境成分的表達進行了Kaplan-Meier分析,并研究了與生存率的潛在聯系。在這些樣本中,血管小生境因子的表達與不良無復發和總生存率顯著相關,表明其在乳腺癌中的潛在作用(圖。3j).

INHBB和SCGB3A1誘導乳腺癌細胞的干細胞特性

已經認識到血管龕產生支持某些惡性腫瘤如腦腫瘤的干細胞特性的分泌因子23。為了在轉移性乳腺癌的背景下解決這一問題,我們研究了來自ECs的條件培養基(CM)刺激癌細胞在超低粘附平板上形成球體的潛力,這是一種促進干細胞屬性的方法24,25。EC-CM顯著增強了乳腺癌細胞的球體形成(圖。4a).因此,我們想說明四種血管小生境成分中的每一種促進球體形成的潛力。用來自HEK293T細胞的含有個體小生境因子的CM處理SUM159-LM1乳腺癌細胞,并測定六鉤蚴的形成。當用含有INHBB或SCGB3A1的CM處理時,乳腺癌細胞的成球能力顯著增加,但用OPG或LAMA1處理時則沒有(圖。4b).考慮到這些結果,我們用重組激活素INHBB的同型二聚體)或重組SCGB3A1刺激SUM159-LM1乳腺癌細胞,這也誘導癌細胞形成球體(圖。4c).此外,從用短發夾狀RNA轉導的肺內皮細胞獲得的CMINHBB與對照CM相比,顯示出刺激六鉤蚴的可能性降低(擴展數據圖。4i,j).該結果表明INHBB和SCGB3A1在乳腺癌細胞中促進干細胞特性的推定作用。為了進一步探索這種聯系,我們對用激活素B或SCGB3A1處理的SUM159乳腺癌細胞進行了轉錄組分析,并揭示了它們各自的反應特征(圖。4d,e和補充表格78).值得注意的是,在激活素B信號中,DNA結合和細胞分化(ID)蛋白抑制因子家族的三個成員(ID1、ID2和ID3)是最高的誘導基因(圖。4d).這些蛋白質被認為能促進干細胞自我更新和多能性,以前被證明能促進乳腺癌細胞的轉移定居26,27.

圖INHBB同型二聚體、激活素B和SCGB3A1促進乳腺癌細胞的干細胞特性。
figure 4

a用來自ST1.6R人肺ECs的CM培養的SUM159-LM1乳腺癌細胞的六球蚴形成。厘米, n= 9;厘米+, n=來自3個獨立實驗的9個技術重復。比例尺,250 μmb,分析用含有血管小生境指示因子的HEK293衍生的CM刺激的SUM159-LM1乳腺癌細胞中的六球蚴形成??刂?,n= 24;INHBB,n= 12;LAMA1,n= 12;SCGB3A1,n= 12;OPG,n=來自4個獨立實驗的12個技術重復。c用重組激活素B (ActB,50 ng ml)刺激SUM159-LM1中的六鉤蚴形成–1)或SCGB3A1 (S3A1,1 μg ml–1).肌動蛋白, n= 8;肌動蛋白+, n= 8;S3A1, n= 9;S3A1+, n=來自4個(ActB)或3個(S3A1)獨立實驗的9個技術重復。ac, P數值由比率配對、雙尾t-來自生物學獨立實驗的測試。方框用上四分位數和下四分位數表示中值,觸須表示最小值和最大值。d,e、響應ActB的最高上調基因的熱圖(d)或S3A1(e). f,GSEA裝置的示意圖,用于分析根據ActB或S3A1信號(ActB-S或S3A1-S)的表達分層的乳腺癌患者的數據集。g,h干細胞相關基因集合在代謝(g)或者,GSE14018(h)數據集。干細胞標記如下所示:A,Lim _乳腺干細胞up;b、Lee _神經嵴干細胞up;c、Oswald _造血干細胞在膠原凝膠中凝固;d、山下_肝癌干細胞up;e,Ivanova _造血干細胞(全部來自C2 MSI gdb保藏中心)。代謝發現中來自三陰性乳腺癌樣本的數據集(上限和下限,n= 66)和GSE14018中乳腺癌的肺轉移(上限和下限,n= 8)進行了分析。FDR由下式確定P通過隨機排列測試計算的值。*FDR < 0.25,**FDR < 0.05。iKaplan-Meier分析er的無復發生存率根據ActB-S或S3A1-S的表達分層的乳腺癌患者;n= 347名患者。P數值由對數秩檢驗確定。j總結了INHBB和SCGB3A1在乳腺癌轉移中的作用的發現。

源數據

為了研究臨床樣本中與激活素B或SCGB3A1信號相關的潛在干細胞表型,我們根據激活素B或SCGB3A1信號的表達對乳腺癌患者(代謝或肺轉移樣本)的基因表達數據集進行了分層(圖。4f和補充表格78).GSEA揭示,具有高活化素B或SCGB3A1介導的基因反應的患者表現出多種干細胞特征的富集(圖。4g,h).重要的是,Kaplan–Meier分析顯示激活素B和SCGB3A1信號都與乳腺癌患者的不良臨床結果相關(圖。4i).總之,這些結果表明INHBB和SCGBA1促進乳腺癌細胞的干細胞特性和侵襲性(圖。4j).

OPG和LAMA1支持轉移性乳腺癌細胞的生存力

在OPG潛在的TRAIL誘餌受體的作用下21我們分析了它在肺轉移中的作用。TRAIL在肺微環境中高度表達(圖。5a)并且是轉移期間肺中細胞凋亡的重要調節劑28。我們通過在OPG水平增加的情況下切割caspase 3的表達,分析了TRAIL誘導的MDA231-LM2乳腺癌細胞凋亡,并觀察了OPG介導的對TRAIL的保護作用(圖。5b).這表明,在轉移相關的內皮細胞中誘導的OPG可能保護侵襲性癌細胞免受TRAIL誘導的凋亡。事實上,我們在小鼠中觀察到過度表達OPG的轉移瘤與對照轉移瘤相比凋亡減少(圖。5c).TRAIL誘導的凋亡由死亡受體4和5 (DR4/5)介導29,30。為了說明這些受體對肺轉移定居的重要性,我們在MDA231乳腺癌細胞中誘導shRNA介導的DR4/5敲低(擴展數據圖。4k)并通過靜脈注射到NSG小鼠體內。DR4/5敲除增強了肺的轉移定殖(圖。5d)并且在肺結節中觀察到較少的凋亡(圖。5e),表明這種機制在保護肺免受轉移定植中起作用。

圖5: OPG和LAMA1調節乳腺癌細胞存活。
figure 5

a從NSG小鼠分離的不同器官組織中的TRAIL信使RNA水平;n=每組3只小鼠。通過qPCR測定表達。數據是s.e.m .的平均值。b左,用TRAIL (50 ng ml)處理的MDA231-LM2細胞中裂解的胱天蛋白酶3表達的免疫印跡分析–1)和指定濃度的OPG。正確,定量基于裂解和未裂解的胱天蛋白酶3之間的比率。顯示了來自三個獨立實驗的平均值。采用單向方差分析和Dunnett多重比較檢驗進行統計分析。c對注射了表達OPG的MDA231癌細胞的小鼠的肺轉移中裂解的胱天蛋白酶3表達的免疫熒光分析。頂,有代表性的例子;細胞核用DAPI染色。比例尺,100 μm。底部,定量;n= 5(控制)和n= 3 (OPG)。值是平均值,帶有標準誤差單位。P數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。d用shRNA對照(shControl)或針對死亡受體4和5的shRNA(shdr 4/5,兩個獨立的發夾)轉導的MDA231癌細胞的肺定殖。顯示了靜脈注射后21天的代表性生物發光圖像(頂部)和標準化光子通量(底部);n=每組5只小鼠。方框顯示上四分位數和下四分位數的中間值,觸須表示最大值和最小值。P數值通過單尾Mann-Whitney檢驗進行計算。e切割胱天蛋白酶3分析肺轉移d。頂,有代表性的例子;DAPI染色的細胞核。比例尺,100 μm。底部,定量;n= 5只小鼠(對照和1號shDR4/5)和n= 3只小鼠(2號shDR4.5)。數據是s.e.m .的平均值。P數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。f在LN111或LN121上接種的乳腺癌細胞中樁蛋白表達的免疫熒光分析。DAPI被用來給細胞核染色。箭頭表示粘連處的致密樁蛋白;n= 3.比例尺,20 μmg分析涂布在LN111或LN121上的乳腺癌細胞的擴散。顯示的是在三個獨立實驗中檢測的所有細胞的相對細胞面積,平均值和標準差h切割的胱天蛋白酶3在鋪在LN111或LN121基質上的乳腺癌細胞中的表達。數據是三個獨立實驗的平均值。比例尺,100 μmi,j整合素β1在層粘連蛋白誘導的細胞鋪展和存活中的作用。相對小區面積(i)和裂解的胱天蛋白酶3表達(j)在鋪在LN111或LN121基質上的細胞中進行分析,所述基質具有或不具有針對整聯蛋白β1的中和抗體(抗int。β1).顯示的是所有受檢細胞的相對細胞面積的平均值±標準差(i)或與s.e.m .(j)來自三個獨立的實驗。P用Dunnett的單因素方差分析確定數值(g,h)或Tukey的(i,j)來自三個獨立實驗的多重比較測試。**P< 0.01, ***P< 0.001. k示意圖總結了OPG和LAMA1在乳腺癌轉移中的功能。

源數據

為了分析LAMA1的功能作用,我們將乳腺癌細胞鋪在涂有LN111或LN121的表面上,ln 111或ln 121是唯一含有LAMA1轉錄的α鏈的層粘連蛋白三聚體。這導致了病灶粘附的增強,這是基于樁蛋白的表達增加和間斷定位,細胞擴散增加(圖。5f,g).此外,對血清饑餓條件下乳腺癌細胞中裂解的胱天蛋白酶3表達的分析顯示,LN111和LN121可以抑制凋亡(圖。5h).值得注意的是,LN111和LN121誘導的擴散和抗凋亡依賴于乳腺癌細胞表達的粘附受體整合素β1(圖。5i,j).總之,關于OPG和LAMA1功能的結果表明,它們分別促進保護乳腺癌細胞免受TRAIL誘導的凋亡和粘附介導的存活(圖。5k).

血管小生境由轉移肺中的巨噬細胞調節

為了確定乳腺癌細胞是否直接誘導血管小生境成分,我們用來自MDA231-LM2癌細胞的CM處理肺內皮細胞,并分析小生境基因的表達。然而,來自癌細胞的CM不誘導ECs中的生態位因子(擴展數據圖)。5a),表明誘導可能需要另一種細胞類型。鑒于此,我們使用GSEA分析根據GSP58分層的肺轉移樣本的特性(圖。6a)并觀察到表達高GSP58的樣品顯示出先天免疫細胞的基因標記的富集(圖。6b).因此,我們檢測這些細胞是否可能是血管小生境的誘導物,并選擇中性粒細胞和巨噬細胞進行進一步分析。來自活化的巨噬細胞系(RAW264.7)而非中性粒細胞系(HL60)的CM促進了肺ECs中小生境成分的表達(圖。6c和擴展數據圖。5b).這表明巨噬細胞可能是轉移誘導的內皮細胞變化的中間體。我們對肺轉移結節中的F4/80巨噬細胞標志物進行了免疫熒光分析,觀察到大量的浸潤性巨噬細胞經常位于血管中(圖。6d,e和擴展數據圖。5c).為了分析這種巨噬細胞群的身份,我們使用流式細胞術并測定了CD170和CD11b的表達,它們可以區分局部肺泡巨噬細胞(CD170+CD11b)和骨髓來源的間質巨噬細胞(CD170CD11b+).我們分析了通過MDA231-LM2(在NSG小鼠中)或4T1(在BALB/c小鼠中)從健康小鼠肺或轉移肺中分選的巨噬細胞。這些實驗表明,間質巨噬細胞,而不是肺泡巨噬細胞,在轉移過程中增加(圖。6f,g和擴展數據圖。5d,e).VEGFR1的表達,結合F4/80,也被證明是間質巨噬細胞的標志31對轉移結節中的VEGFR1、F4/80和CD31的免疫熒光分析表明,在CD31附近發現了VEGFR1和F4/80雙陽性巨噬細胞+擴展數據圖。5f).這表明間質巨噬細胞可能是血管周圍生態位的誘導物。

圖6:肺轉移瘤中血管周圍巨噬細胞調節內皮小生境。
figure 6

a,用于分析根據GSP58分級的人類轉移樣本的數據集的GSEA設置的示意圖。所有肺轉移患者(16名患者)均選自GSE14018。b表達GSP58的人肺轉移瘤細胞功能豐富。細胞功能是基于NES進行排名的。FDR由下式確定P通過隨機排列測試計算的值。c,在用來自原始或活化的巨噬細胞系RAW264.7的CM處理的ECs中的生態位因子的表達SCGB3A1)或者五個(INHBB, LAMA1氧基聚明膠)顯示獨立實驗。統計分析采用比率配對,雙尾t-測試。d小鼠肺轉移結節中內皮細胞(CD31,白色)、巨噬細胞(F4/80,紅色)和MDA231-LM2 (GFP,綠色)的免疫熒光分析。顯示的是來自四個獨立樣本的代表性圖像。箭頭表示巨噬細胞在血管周圍的定位。比例尺,50 μme具有浸潤的巨噬細胞的結節的定量(百分比)( mac。)或與血管相關的巨噬細胞。f,g通過流式細胞術分析健康小鼠或患有肺轉移的小鼠肺中的巨噬細胞亞群。在MDA231-LM2-(f)和4T1介導的(g3)分別在NSG或BALB/c小鼠中的肺轉移;n= 3(控制),n= 5(轉移,f)和n= 4(轉移,g).顯示了帶有s.e.m .的含義。h,氯膦酸鹽的實驗裝置(clod。)-介導的肺轉移小鼠巨噬細胞耗竭,隨后對肺ECs進行轉錄分析。i火山圖顯示巨噬細胞耗竭后肺ECs中基因的差異表達(GSP58以紅色突出顯示)。j,Violin圖顯示了巨噬細胞去除后,來自轉移小鼠肺的ECs中GSP58的表達。P用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗確定數值;n=每組3個。k在純化的肺內皮細胞中表達內皮小生境因子hj。用qPCR測定mRNA水平;n= 3只老鼠。圖中顯示的是平均值和P采用Holm–Sidak多重比較測試,通過單向ANOVA計算數值。*P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001, ?P= 0.086.l在氯膦酸鹽-脂質體處理后,MDA231-LM2細胞在小鼠中的肺定殖。第14天的代表性生物發光(左)和標準化光子通量(右);n= 5只小鼠(載體和PBS脂質體)和n= 3只小鼠(氯膦酸鹽-脂質體)。方框顯示具有上下四分位數的中間值,而觸須代表最小值和最大值。P數值通過單尾Mann-Whitney檢驗進行計算。

源數據

為了研究巨噬細胞在內皮細胞活化和轉移定居中的功能作用,我們使用氯膦酸鹽脂質體(圖。6小時和擴展數據圖。5g,h).我們從小鼠中分離出肺內皮細胞,進行轉錄組分析,并觀察到巨噬細胞去除抑制了內皮細胞中GSP58內許多基因的表達,包括Inhbb, Lama1, Scgb3a1氧基聚明膠(圖。6i–k).有趣的是,盡管EC增殖基因的表達不受巨噬細胞耗竭的影響,但EC炎癥反應卻被顯著抑制(擴展數據圖。5i–m).這些結果表明,轉移相關的巨噬細胞誘導了肺內皮細胞的炎癥反應。與異種移植小鼠模型的發現一致,在完全免疫活性的4T1小鼠乳腺腫瘤模型中消除巨噬細胞也抑制了四種小生境基因的表達,表明巨噬細胞是完整免疫系統中血管小生境因子的關鍵調節因子(擴展數據圖。6a–c).此外,與體外結果一致,在4T1模型中消除嗜中性粒細胞后,沒有觀察到小生境因子表達的變化(擴展數據圖。6d–f).最后,巨噬細胞的減少顯著抑制了MDA231-LM2癌細胞在肺中的轉移定居(圖。6l).總之,這些結果表明,在肺轉移過程中,血管周圍巨噬細胞起著血管生態位的調節作用。

TNC-TLR4激活的巨噬細胞誘導內皮小生境

細胞外基質越來越被認為是癌癥進展和轉移的重要調節劑32,33,34。TNC是由乳腺癌細胞表達的基質糖蛋白,是肺轉移的關鍵小生境成分和促進劑35。在乳腺癌細胞中,TNC表達與基礎亞型和間充質表型都相關(擴展數據圖。6克,高和補充表格9).我們使用免疫熒光分析來探索TNC相對于轉移相關巨噬細胞和內皮細胞的定位,并觀察到TNC與轉移結節中的兩種細胞類型共定位(圖。7a).此外,在乳腺癌患者的轉移瘤中,TNC表達——或來自活化巨噬細胞的基因標記的表達36—患者樣本中GSP58表達相互重疊,表達水平相互關聯(圖。7b,c和擴展數據圖。6i).這表明TNC、轉移相關巨噬細胞和人類轉移瘤中血管小生境的激活之間存在聯系。有趣的是,以前的研究表明,TNC可以結合并激活不同細胞類型中的TLR4,導致關節炎小鼠模型中的炎癥信號37。根據這些發現,我們觀察到用重組TNC處理的巨噬細胞誘導表達。Tnf, Il1b、Il6Nos2作為激活標記物,這被TLR4抑制劑(TLR4i)逆轉(圖。7d).然而,盡管重組TNC可以影響內皮細胞的粘附特性,但它不能直接誘導血管小生境成分的表達(擴展數據圖。6j,k).此外,乳腺癌細胞中的TNC表達不受EC-CM或重組血管小生境因子治療的影響(擴展數據圖。6l).考慮到巨噬細胞對血管生態位的調節,我們假設血管周TNC可能參與了巨噬細胞的激活,從而誘導了轉移中的血管生態位成分。為了在體內解決這個問題,我們給NSG小鼠靜脈注射了對照或TNC敲除的MDA231-LM2癌細胞(圖。7e頂部和擴展數據圖。6m).與之前的研究一致35,38,TNC缺乏抑制了乳腺癌細胞的轉移定居(圖。7f).我們使用FACS從具有對照或TNC敲除轉移的小鼠中分離出內皮細胞,并通過微陣列測定GSP58的表達(擴展數據圖。6n).大多數GSP58基因在TNC敲除轉移中被抑制(擴展數據圖。60便士).此外,從小鼠分離的ECs的定量PCR (qPCR)分析證實,四種小生境因子的表達在轉移中以TNC依賴的方式被誘導(圖。7g).為了進一步研究TNC對巨噬細胞的直接作用和隨后內皮細胞生態位的激活,我們將內皮細胞與TNC處理的RAW264.7巨噬細胞共培養,并分析了四種生態位組分的表達。TNC處理的巨噬細胞在共培養的內皮細胞中誘導了小生境因子(擴展數據圖。7a).鑒于此,我們旨在揭示TNC激活的巨噬細胞的哪些因子負責誘導血管小生境。我們用TNC單獨或與TLR4i聯合刺激巨噬細胞,并進行轉錄組分析。五氯苯甲醚顯示了TNC誘導的主要變化,TLR4i聯合治療逆轉了這些變化(擴展數據圖。7b).GSEA表明,Toll樣受體信號(KEGG)在TNC刺激的巨噬細胞中富集,當包括TLR4i時表現不明顯(擴展數據圖。7c).此外,violin圖分析顯示了轉移相關的巨噬細胞信號的誘導39由TNC以依賴于TLR4的方式(擴展數據圖。7d).與巨噬細胞表型相關的基因特征的進一步研究40,41表明TNC可以誘導與不同表型相關的變化,如經典炎癥巨噬細胞表型(M1)、選擇性活化巨噬細胞(M2)和傷口愈合表型(擴展數據圖)。7e–g).為了解決TNC刺激的巨噬細胞的潛在旁分泌效應,我們分析了分泌蛋白的基因,觀察到75種由TNC誘導,其中54種依賴于TLR4(擴展數據圖。7h,我和補充表格10).為了確定巨噬細胞的TNC誘導因子是否能促進內皮細胞中的小生境成分,我們研究了一組20種這樣的細胞因子Nos2以TLR4依賴的方式被TNC誘導(圖。7d),我們還包括了一種NO誘導NONOate作為興奮劑。在這些因素中,只有非基因上調INHBBSCGB3A1而壬二酸和TNF-α都誘導LAMA1氧基聚明膠(擴展數據圖。7j).重要的是,來自小鼠轉移結節的ECs顯示出對TNF和NO的高反應性(擴展數據圖)。7k,l).這些結果表明,巨噬細胞產生的NO和TNF可以激活血管小生境。

圖7:TNC-TLR4軸促進血管周圍巨噬細胞的活化,隨后在肺中形成促轉移內皮小生境。
figure 7

a小鼠肺轉移瘤MDA231-LM2中TNC(紫色)、巨噬細胞(F4/80,綠色)和ECs (CD31,藍色)的免疫熒光分析。箭頭表示TNC和巨噬細胞在血管周圍共存。虛線表示轉移的邊緣。顯示的是來自四個獨立樣本的代表性圖像。比例尺,50 μmb根據GSP58的表達,對65例人乳腺癌轉移瘤(GSE14020)進行分級聚類。TNC-或經典活化的巨噬細胞標記(CAM-S)-陽性轉移用紅條表示。c乳腺癌患者65個轉移樣本中指示參數的相關性分析。皮爾遜線性回歸r雙尾的P顯示值。d用重組TNC或TNC和TLR4i (TAK-242)的組合處理6小時的巨噬細胞中指定標記物的表達;n= 3 (Nos2)或者n= 4 (Tnf, Il1bIl6)獨立實驗。顯示的是帶s.e.m .的平均值e的實驗大綱,顯示了用shRNA對照(shControl)或針對TNC的shRNA(shTNC)轉導的MDA231-LM2癌細胞,靜脈注射(i.v .)到小鼠中(上圖)或MDA231-LM2細胞靜脈注射到小鼠中,隨后用TLR4i處理(下圖)。f在注射了shControl或shTNC(兩種獨立的發夾)轉導的乳腺癌細胞的小鼠中,基于生物發光的肺轉移;n=每組6只小鼠。P通過單尾Mann-Whitney檢驗計算的值。g血管周圍生態位因子在肺轉移內皮細胞中的表達f; n= 4只老鼠。數據是平均值,與s.e.mP采用Holm–Sidak的多重比較測試,通過單向ANOVA確定數值。*P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001. h對具有轉移灶并用TLR4i治療的小鼠肺進行生物發光分析。對于MDA231-LM2和對照,n= 10只小鼠;TLR4i,n= 8只小鼠;4T1和控制,n= 8只小鼠;TLR4i,n= 9只老鼠。P數值通過單尾Mann-Whitney檢驗進行計算。i在從具有MDA231-LM2轉移的肺中分離的內皮細胞中,指示基因的表達h; n= 4只小鼠(用載體治療的對照和轉移)和n= 3只小鼠(用TLR4i治療的轉移)。數據是平均值,與s.e.mP采用Holm–Sidak的多重比較測試,通過單向ANOVA確定數值。*P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001. j,原位模型中自發性肺轉移的實驗概要。將MDA231-LM2癌細胞移植到第四個乳房脂肪墊,并跟蹤其生長24天,然后手術切除腫瘤。從第25天開始用TLR4i治療小鼠。k小鼠肺轉移j。左,離體生物發光;右,轉移的量化;n= 6(車輛)和n= 3 (TLR4i)。P數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。l四種小生境因子在從具有轉移的小鼠中分離的EC肺中的表達,并且用載體或TLR4i處理,如j,k。數據是從以下來源獲得的平均值n= 6只小鼠(載體)和n= 3只小鼠(TLR4i)。P數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。*P?<?0.05. d,g,i,l通過qPCR確定表達。m,n拯救實驗,其中在TNC敲除的情況下,小生境因子在轉移性乳腺癌細胞中異位表達(m)或TLR4i治療(n)在肺部定植期間;n=每組6只小鼠。P數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。f,h,k,m,n,方框顯示具有上下四分位數的中值,觸須表示最大值和最小值。

源數據

為了闡明TLR4作為血管小生境調節因子的功能作用,我們用TLR4i和分離的內皮細胞治療轉移小鼠進行分析(圖。7e,底部)。盡管TLR4i治療不影響巨噬細胞的募集,但它顯著降低了活化(擴展數據圖。8a、b).重要的是,TLR4的抑制導致了血管小生境成分的下調,并阻礙了肺的轉移定居(圖。7h,左和7i).考慮到先天免疫和獲得性免疫之間的相互影響,我們研究了TLR4在具有免疫活性的4T1乳腺腫瘤模型中的功能作用。與異種移植模型的結果一致,TLR4i治療抑制了4T1模型中的轉移定居(圖。7h右),這些結果在自發性肺轉移的原位小鼠模型中得到了關鍵的再現(擴展數據圖。8c).盡管TLR4抑制作用沒有顯著影響乳腺腫瘤的生長,但TLR4i降低了轉移結節的大小和數量(擴展數據圖。8d,e).值得注意的是,原位小鼠模型中的肝臟分析顯示TLR4i治療后顯著減少了肝轉移(擴展數據圖。8f).為了從模擬臨床環境的模型中提供證據,我們分析了轉移進展和四種小生境成分在小鼠內皮細胞中的表達,這些小鼠的原發性腫瘤在轉移分析前已經手術切除。在原發性腫瘤切除后,在TNC敲除或TLR4i治療的轉移的情況下進行實驗(圖。7j和擴展數據圖。8g).TNC敲除和TLR4i治療都降低了肺轉移負擔,并抑制了肺ECs中四種小生境成分的表達(圖。7k,l和擴展數據圖。8h,我).最后,我們研究了在沒有TNC或TLR4功能的情況下,這四種小生境因子的過度表達是否可以避免巨噬細胞的激活并恢復減少的轉移灶。事實上,四種小生境成分的異位表達拯救了腫瘤轉移小鼠的TNC敲除和TLR4抑制(圖。7m,n).總之,這些結果表明了轉移中的基質相互作用,其中癌細胞產生激活巨噬細胞的TNC,從而促進促轉移血管龕的形成。

聯合抑制TLR4和血管內皮生長因子阻止肺轉移

我們的發現表明了由VEGF調節的EC基因和由活化的巨噬細胞調節的EC基因之間的區別。為了進一步解決這一問題,我們分析了從轉移肺中分離的內皮細胞的轉錄組變化,并將其與用抗VEGF抗體治療的小鼠內皮細胞的表達變化進行了比較。來自GSEA的結果表明,巨噬細胞依賴的EC基因誘導與炎癥反應和GSP58特別相關,而VEGF依賴的誘導導致刺激增殖(圖。8a).有鑒于此,我們研究了抗TLR4和抗VEGF聯合治療是否能提高抑制轉移的療效。我們用TLR4i和抗VEGF抗體單獨或一起治療異種移植和同系轉移小鼠(圖。8b).結果顯示,與單一治療相比,聯合抑制TLR4和VEGF提供了更好的抑制轉移的功效(圖。8c,d).考慮到聯合治療對腫瘤誘導的免疫反應的潛在影響,我們分析了T細胞衰竭標記物和調節性T細胞(Tregs)、自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和中性粒細胞的存在——在同系小鼠轉移模型(4T1模型)中,小鼠用TLR4i和抗VEGF抗體治療。盡管我們觀察到轉移瘤中所有這些標記物的誘導,但聯合治療并不影響反應(擴展數據圖。9a–e).然而,在聯合治療后,我們觀察到轉移癌細胞的凋亡增加,增殖減少(圖。8e和擴展數據圖。10a).我們在原位環境中用TLR4i和抗VEGF抗體治療小鼠,其中在植入后第22天手術切除乳腺脂肪墊腫瘤,并在第23天開始治療(擴展數據圖。10b).聯合TLR4i和抗VEGF治療顯著抑制肺轉移(擴展數據圖。10c).值得注意的是,來自代謝研究的發現數據集的分析揭示了VEGF和TLR4信號的表達42,43在患者樣本中與較差的總存活率相關(擴展數據圖。10d).總之,我們的結果描述了不同的內皮激活特性,其中巨噬細胞介導的炎癥誘導血管小生境蛋白的產生,VEGF信號促進內皮細胞增殖(圖。8f).這些結果為探索TLR4i聯合抗VEGF治療抑制轉移瘤血管功能提供了理論基礎。

圖8: TLR4抑制和抗VEGF治療針對不同的血管功能,聯合治療進一步阻止肺轉移。
figure 8

aGSP58的GSEA,在來自患有巨噬細胞耗竭的肺轉移瘤(氯膦酸鹽-脂質體)或用抗VEGF療法治療的轉移瘤(B20)的小鼠的ECs中表達的炎癥或增殖相關信號。bd在具有肺轉移的小鼠中抑制TLR4和VEGF。b的實驗大綱,其中小鼠靜脈注射指定的乳腺癌細胞并用TLR4i或B20作為單一治療或一起作為組合治療進行治療。c,d在注射MDA231-LM2的小鼠中肺轉移集群的生物發光分析(c)或4T1(d)癌細胞,并按照中所述進行處理b。左,代表性的生物發光圖像;對,基于生物發光信號的肺轉移的量化。MDA231-LM2,n= 11只小鼠;4T1,n= 5只小鼠(單次TLR4i或B20處理)和n= 4只小鼠(對照或雙重治療)。P數值通過單尾Mann-Whitney檢驗進行計算。e通過用TLR4i、B20或兩者的組合治療的轉移結節中裂解的胱天蛋白酶3的表達進行凋亡的免疫熒光分析;n=每組5只小鼠。比例尺,50 μmP數值由單尾Mann-Whitney檢驗確定。ce,方框顯示具有上下四分位數的中值,觸須表示最大值和最小值。f描述了血管活化的兩個調節臂的模型,其中VEGF促進了受TNC-TLR4信號刺激的內皮細胞和巨噬細胞的增殖,促進了內皮細胞的炎癥反應和癌細胞利用的血管小生境的促轉移因子的分泌。顯示了乳腺癌細胞和巨噬細胞之間通過TNC-TLR4軸的相互作用,這導致巨噬細胞活化,隨后通過NO和TNF誘導血管周圍小生境,產生促轉移因子,包括INHBB、OPG、LAMA1和SCGB3A1。INHBB和SCGB3A1在乳腺癌細胞中誘導干細胞特性,而OPG和LAMA1促進癌細胞在轉移部位的存活。

源數據

討論

在這項研究中,我們描述了肺內皮細胞在轉移過程中的特征性變化。我們證明了在肺轉移過程中,定殖乳腺癌細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞之間血管周圍位點的特定分子串擾的關鍵作用。這項研究為轉移過程中的血管調節提供了見解,揭示了VEGF誘導的增殖和巨噬細胞誘導的炎癥反應之間的區別。全局轉錄組分析顯示,與細胞增殖和血管生成相關的VEGF調節的基因表達模式在轉移相關的肺內皮細胞中被誘導。然而,結果也揭示了內皮細胞的炎癥反應導致大量分泌蛋白(GSP58)的產生,這些分泌蛋白在很大程度上不依賴于VEGF,其中我們鑒定了INHBB、LAMA1、SCGB3A1和OPG為轉移中血管龕的關鍵分泌成分。

越來越多的證據表明,內皮細胞在發育、組織穩態和疾病過程中的細胞間通訊中起著重要的作用6。參與細胞串擾的跨膜或分泌型內皮因子被稱為血管分泌因子,可影響癌癥進展44。例如,骨中ECs產生的E-選擇素可以促進癌細胞中上皮-間質轉化和干細胞特性,以進一步轉移定居45。ECs還可以產生特定的細胞外基質蛋白,調節播散性乳腺癌細胞的休眠和激活狀態,并可能增強對治療干預的抗性9,46。靶向VEGF的抗血管生成療法已被應用于晚期乳腺癌患者的治療方案中。然而,乳腺癌患者從VEGF中和中獲得的臨床益處是有限的47,48。我們的結果表明,盡管抗VEGF治療抑制了內皮細胞的增殖,但它可能無法阻斷肺轉移過程中內皮細胞的特定血管分泌功能。然而,研究結果也表明,聯合抑制VEGF介導的增殖和巨噬細胞誘導的血管小生境形成可能是抑制轉移中廣泛內皮功能的一種有前途的方法。

我們的發現表明,播散的乳腺癌細胞、活化的巨噬細胞和內皮細胞之間的相互作用對于肺中促轉移血管龕的形成至關重要。巨噬細胞被癌細胞衍生的TNC激活,隨后通過分泌NO和TNF刺激肺ECs,從而引起血管小生境形成。TNC被認為是許多惡性腫瘤中癌癥進展的促進劑,并在高度侵襲性癌細胞中表達49,50。在轉移性乳腺癌細胞中,TNC表達已被證明由JNK信號誘導,并可被轉移抑制微小RNA mir 335(參考文獻。38,51).除了改變腫瘤基質外,乳腺癌細胞表達的TNC還以自分泌方式發揮作用,調節Notch和Wnt信號成分以促進細胞的轉移適應性35。在這里,我們揭示了癌細胞產生的TNC如何通過TLR4啟動巨噬細胞的激活,導致血管龕的誘導。值得注意的是,TNC誘導的TLR4活化已被證明發生在關節炎的情況下37。TNC由多個結構域組成,其中C端纖維蛋白原globe被證明能結合并激活TLR4(參考文獻。37,52).在生長轉移中,癌細胞不是TNC的唯一來源,因為活化的成纖維細胞可以產生高水平的TNC50。然而,研究表明反應性成纖維細胞表達TNC發生在較晚的時間點,因此,在早期轉移中,癌細胞是TNC的主要來源35。雖然來自成纖維細胞的TNC可能有助于血管龕,但我們的結果表明,癌細胞產生的TNC對活化過程至關重要。

生長中的原發性腫瘤可以在定殖之前引起次級器官的特定變化,導致促進這些器官定殖的預轉移小生境的產生53。這些變化中的一些可能會影響血管,如最近顯示的富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(參考文獻。54).然而,我們的發現表明這四個血管小生境基因不是由原發性腫瘤的分泌因子誘導的。我們的結論是,由侵入肺部的癌細胞產生的TNC啟動了級聯反應,導致了促轉移血管龕的形成。

根據來源和功能,巨噬細胞被認為表達異質性表型。我們的結果表明,對肺部血管龕起調節作用的前轉移巨噬細胞是間質性的,即從血液循環中招募的,而不是局部肺泡巨噬細胞。這與先前的發現一致,即肺泡巨噬細胞對于轉移進展是不可或缺的,而從血液循環中募集的巨噬細胞對于轉移是必需的31。我們研究了TNC誘導的巨噬細胞表型,并觀察了經典炎癥表型(M1)的誘導,以及選擇性激活巨噬細胞(M2)的特征和傷口愈合特性。重要的是要注意到越來越多的證據表明,巨噬細胞的極化可能比以前理解的更復雜和可塑性更強55。例如,乳腺腫瘤微環境中的單細胞分析表明,腫瘤相關巨噬細胞可以同時表現出M1和M2特征56.

總之,我們的發現描述了肺轉移瘤生長過程中多方面的細胞干擾。結果顯示了血管小生境在轉移過程中的關鍵作用,并強調了細胞外基質在其調節中的作用。這些轉移結節中的相互作用可以作為開發未來治療轉移疾病的有用靶點。


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