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HDLBP通過多價相互作用結合ER靶向mRNAs,促進跨膜和分泌蛋白的蛋白合成

 二維碼
發表時間:2022-05-25 14:02作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

RNA結合蛋白在分泌途徑中的生物學作用尚未完全確定。在這里,我們描述了人類HDLBP/Vigilin直接與超過80%的ER定位mRNAs相互作用。PAR-CLIP分析顯示,這些轉錄物代表高親和力的HDLBP底物,并特異性結合于其編碼序列(CDS ),與CDS/3’UTR結合的胞質mRNAs相反。HDLBP與長的富含銅的基序強烈交聯,這些基序經常位于ER定位的mRNAs的CDS中,并導致高親和力的多價相互作用。除了HDLBP-ncRNA相互作用組,HDLBP近端蛋白質組的定量證實了與翻譯裝置和信號識別顆粒的成分的關聯。缺乏HDLBP導致HDLBP靶mRNAs的翻譯效率降低,模型細胞系中蛋白質合成和分泌受損,以及肺癌小鼠模型中腫瘤生長降低。這些結果強調了HDLBP在ER定位mRNAs翻譯中的一般功能及其與腫瘤進展的相關性。

介紹

在真核細胞中,功能蛋白產物的定位很大程度上取決于它們的翻譯位點。當可溶性蛋白質在胞質溶膠中翻譯時,靶向內質網(ER)的共翻譯使新合成的蛋白質能夠進入分泌途徑,導致其分泌或膜整合1,2,3,4。典型的分泌途徑始于胞質溶膠中疏水性靶向信號(信號肽或跨膜結構域)的合成5。隨后信號識別顆粒(SRP)與新生肽的結合導致核糖體延伸停滯和核糖體新生鏈復合物(RNCs)的形成6。這使得胞質SRP-RNC通過SRP受體重新定位到內質網膜上,新生肽轉移到內質網腔中7。近年來,在酵母中發現了一種非典型的SRP非依賴性途徑8以及SRP在核糖體參與之前募集到mRNA的證據9和獨立于SRP的ER靶向10,11,12。這增加了識別膜結合mRNAs的未知機制存在的可能性。

mRNA序列中調控元件對于核糖體延伸阻滯和新生鏈識別的潛在作用知之甚少。一些研究已經鑒定了編碼序列(CDS)和3’非翻譯區(3’UTRs)中的元件,這些元件可以區分內質網結合的mRNAs和胞質的mRNAs13,14,15,16,17。然而,可能負責識別這些元件的反式作用因子是未知的。最近,觀察到編碼可溶性蛋白的一小組mRNA也可以在內質網定位和翻譯,表明調節定位mRNA命運的其他機制18。雖然有證據表明在肌肉中存在與丙酮酸激酶相互作用的內質網相關核糖體亞庫19,胞質和內質網結合的核糖體的組成、裝配和活性翻譯狀態的全面差異尚未確定20,21,22。此外,在內質網上發現了一種以前未知的依賴核糖體的無意義介導的衰變(NMD)途徑的變體,提示內質網結合的mRNAs有一個額外的調節層23??傊?,編碼可溶性蛋白和膜蛋白的mrna的翻譯命運可能受到反式作用因子如RNA結合蛋白的嚴格調控,其功能可能超出了典型的SRP依賴模型。

HDLBP(也稱為VIGILIN)是一種保守且普遍表達的RBP,定位于細胞質和內質網膜24,25。它包含15個hnRNPK同源(KH) RNA結合域(RBDs)26。KH結構域是高親和力RNA識別元件(RREs),最常見的是FMRP中觀察到的四核苷酸27、SF1、HNRNPK和其他28。一些也可以識別二分基序,例如IGF2BP蛋白家族29,30,31,32。已發現HDLBP及其酵母直系同源物SCP160對許多生物學過程有貢獻33比如翻譯34,35或者蛋白質聚集36,并與致癌作用有關37,38。最近,高密度脂蛋白被證明是ZIKV黃病毒和登革病毒復制所必需的,很可能是通過增加病毒蛋白質在內質網的翻譯效率24。HDLBP也是心血管研究的一個有希望的靶點,因為它促進極低密度脂蛋白(VLDL)的分泌,并在動脈粥樣硬化傾向的Ldlr中敲除肝臟HDLBP后導致較少的動脈粥樣硬化斑塊?/?老鼠35。有人提出HDLBP與編碼分泌蛋白的mRNAs亞組中含有CHHC或CHYC (H = A/C/U和Y = C/U)的區域結合,并增強其翻譯。然而,高密度脂蛋白結合RNA的功能和翻譯過程中的機械事件仍然不確定。

在這里,我們通過PAR-CLIP在轉錄組范圍內分析了HDLBP結合位點,并發現了它們作為er結合mRNAs選擇性序列決定子的潛在功能。HDLBP與超過80%的內質網定位的mrna直接特異地相互作用,主要與它們的CDS中富含銅的長基序結合,這是一個獨特的特征,與胞質mrna相比,在膜結合的mrna中更常見。生物化學、轉錄組學和蛋白質組學方法被用于評估高密度脂蛋白缺乏對內質網翻譯效率、蛋白質合成和分泌的功能性影響,并強調其對這些生物學過程的要求。最后,我們將我們的發現擴展到體內系統,并評估缺乏高密度脂蛋白對腫瘤形成能力的影響。

結果

HDLBP直接與ER靶向mRNAs相互作用

為了從功能上描述HDLBP與定位轉錄組的相互作用,我們定量了HEK293細胞中胞質和膜結合的mRNAs。使用亞細胞化學分級方法39,我們獲得了胞質溶膠和膜組分,這可以通過存在或不存在區室特異性蛋白標記來證明(補充圖。1a).為了獲得定位的mRNA圖譜,我們接下來對全細胞、胞質溶膠和膜組分進行了mRNA測序(補充圖。1b),導致高度可再現的mRNA豐度定量(補充圖。1c).由于膜-細胞質富集的雙峰分布(圖。1a),我們能夠根據它們在胞質溶膠和膜之間的分配對7000多種mRNAs進行分類(補充數據1).為了驗證這一結果,我們比較了編碼或缺乏共翻譯靶向信號的mRNAs之間的富集值。正如預期的那樣,我們發現,與編碼翻譯后靶向尾錨定蛋白或核DNA編碼的線粒體蛋白的mrna相比,線粒體DNA編碼的蛋白以及信號肽(SP)和跨膜螺旋(TM)編碼的mrna具有更高的膜富集度(圖。1b),驗證我們的方法。

圖1: HDLBP與ER靶向mRNAs結合。
figure 1

a通過測序量化HEK293細胞中膜和胞質mRNA的定位。log2轉化的膜富集的直方圖(膜和胞質讀數之間的比率,兩次重復的平均值)。選擇0.5和1.5的截止值(灰線)來分類膜結合(n= 1157)、胞質(n= 6139)和未定義本地化的mRNAs(n= 193).TPM至少為10的mRNAs被包括在該分析中。bmRNA序列衍生定位的質量控制。在根據編碼的靶向信號(TS)的存在分類的mRNAs組之間比較Log2轉化的膜富集:沒有靶向信號的胞質溶膠定位的mRNAs(n= 5142),編碼線粒體蛋白的mrna,不包括mtDNA編碼的mrna(n= 739),編碼翻譯后靶向尾錨定跨膜蛋白(n= 102),線粒體DNA表達編碼線粒體蛋白的mRNAs(n= 13),沒有已知TS的膜定位mRNAs(n= 107),編碼信號肽(SignalP)的mRNAs包含蛋白質(n= 214)或跨膜螺旋(n= 724)或兩者(n= 282).TPM至少為10的mRNAs被包括在該分析中。箱形圖的上下鉸鏈分別對應于第25和第75個百分點。上須和下須從鉸鏈延伸到最大值或最小值,分別不超過離鉸鏈1.5×四分位范圍。箱線圖的中線描繪了中值。c在HEK293細胞中通過PAR-CLIP檢測到的HDLBP交聯(T-C轉換)在整個轉錄組中的分布。dCDS中標準化HDLBP交聯信號對未分級細胞中mRNA表達水平的散點圖。根據mRNAs在(a).上面的插圖顯示了HDLBP交聯信號的密度分布。eHDLBP結合和未結合mRNAs的定位。顯示了總HEK293胞質和膜結合mrna中HDLBP結合mrna的絕對數量和百分比。f不同mRNA類別的HDLBP部分片段結合富集(兩個生物重復的平均值);不含TS的細胞質定位的mRNAs(n= 1578),編碼線粒體蛋白的mrna,不包括mtDNA表達的mrna(n= 251),編碼翻譯后靶向尾錨定跨膜蛋白(n= 30),沒有已知TS的膜定位mRNAs(n= 74)、編碼信號肽(SignalP)的mRNAs含有蛋白質(n= 138)或跨膜螺旋(n= 492)或兩者(n= 219).箱形圖的上下鉸鏈分別對應于第25和第75個百分點。上須和下須從鉸鏈延伸到最大值或最小值,分別不超過離鉸鏈1.5×四分位范圍。箱線圖的中線描繪了中值。af源數據作為源數據文件提供。

mRNA定位的成功定量促使我們通過PAR-CLIP確定HEK293細胞中的全細胞HDLBP結合轉錄組(補充圖。1d,e).作為T-C轉換檢測到的大多數FLAG/HA-HDLBP交聯信號存在于編碼序列(CDS)和mRNAs的3’非翻譯區(3’UTRs )(補充數據2, 3),以及rRNA和trna(圖。1c).表達水平標準化后(補充圖。1f,g),膜結合mRNA的PAR-CLIP T-C信號呈正態分布,沒有mRNA豐度偏差(圖。1d),表明高密度脂蛋白相互作用對這些mRNAs具有高度特異性。有趣的是,在膜定位的mRNAs中高HDLBP PAR-CLIP富集主要是由于高CDS相互作用,而不是3’UTR結合(補充圖。1h).我們估計總膜結合mRNA庫的80%以上被HDLBP結合(圖。1e).未結合的膜定位的mRNAs包括13個線粒體DNA編碼的基因(補充圖。1i),由于HDLBP不局限于線粒體,因此不被認為是HDLBP的靶標25。相應地,高密度脂蛋白結合的mrna高度富集SP和TM螺旋編碼轉錄物,而對于胞質mrna和那些編碼線粒體蛋白的mrna,觀察到明顯較弱的結合(圖。1f).此外,我們發現編碼尾錨定膜蛋白的mrna沒有富集,這證實了HDLBP以高特異性結合內質網(ER)靶向的mrna。

HDLBP與膜結合和胞質mRNAs轉錄區的差異結合

為了確定高密度脂蛋白-RNA相互作用的分子特征,我們首先檢測了mRNA轉錄區域內高密度脂蛋白交聯位置的相對分布。觀察到T-C位置計數的高再現性(補充圖。2a),使我們能夠構建高分辨率的高密度脂蛋白交聯圖譜。我們觀察到HDLBP與CDS和3’UTR區域的相互結合依賴于mRNA的定位。HDLBP主要與膜結合mrna的CDS相互作用,而對于胞質mrna,這種結合在3’UTR更突出(圖。2a).為了解決CDS、3’UTR結合和mRNA定位之間的關系,我們計算了CDS和3’UTR中檢測到的長度標準化T-C轉換之間的比率,發現膜定位的mRNA比胞質轉錄物具有更高的比率(圖。2b).此外,對總T-C交聯信號的貢獻主要來源于膜結合mRNAs的高CDS結合(圖。2c).比較膜結合mrna IGF2R和COL2A1,以及細胞質HNRNPUL1和FTL轉錄物的T-C轉換模式(圖。2d和補充圖。2b),支持轉錄組分析的結論??傊?,HDLBP靶mrna主要定位于膜并結合在CDS中,而在胞質mrna中,HDLBP結合在CDS和3’UTR之間平均相等。

圖HDLBP與ER靶向和胞質轉錄物的差異結合。
figure 2

a胞質和膜結合mRNAs的HDLBP交聯信號的元轉錄本分析。每個核苷酸的T-C轉換信號根據文庫大小(每百萬T-C)進行標準化。每百萬中至少有5個T-C的轉錄本被包括在這個分析中。百萬分之T-C換算成每個轉錄本的最大T-C信號。在每個位置,繪制了平均比例T-C信號。bCDS中的HDLBP交聯與3’UTR的比率相對于胞質和膜結合mRNA的每個mRNA的總交聯的散點圖。c根據每個mRNA的總HDLBP交聯分為三組(n= 16: TC <0.3,膜,n= 65: 0.3 < TC <1.39,膜,n= 35:,TC >1.39,膜,n= 279: TC <0.3,胞質,n= 379: 0.3 < TC <1.39,胞質,n= 144: TC >1.39,胞質),并繪制了CDS的分布與HDLBP交聯的3’UTR比的關系。箱形圖的上下鉸鏈分別對應于第25和第75個百分點。上須和下須從鉸鏈延伸到最大值或最小值,分別不超過離鉸鏈1.5×四分位范圍。箱線圖的中線描繪了中值。dIGF2R(膜結合)和HNRNPUL1(胞質)mRNAs中PAR-CLIP閱讀覆蓋和T-C轉換的瀏覽器表示。讀數被映射到人類mRNA序列。顯示了5’UTR、CDS和3’UTR區域。顯示了抄本id。ad源數據作為源數據文件提供。

HDLBP結合的RNA識別元件在膜結合的mrna中更常見

我們接下來研究了強調HDLBP對膜結合mRNAs特異性的主要序列特征。我們根據每個轉錄本的交聯信號中值對交聯的七聚體進行排序(補充圖。3a)和T-C交聯位置相對于所有交聯七聚體的頻率(圖。3a).這兩個指標在定位于膜或胞質溶膠的mRNAs的CDS和3’UTR之間進行了比較。我們發現HDLBP最常與含銅的七聚體交聯,其UUC/UC/CUU/CU重復序列的數量可變,位于膜結合mRNAs的CDS中(圖。3a,b和補充圖。3a).

圖3:膜結合mRNAs的HDLBP特異性。
figure 3

a位于膜結合和胞質mRNAs的3’UTR或CDS中的前十個高密度脂蛋白交聯七聚體的頻率。b根據在所有檢測到的交聯七聚體中的頻率排列的前五個HDLBP交聯七聚體的序列標志。c的分布z-根據膜結合和胞質CDS和3’UTR序列中所有可能的k-mers的頻率差異計算的得分。對于每個k-mer長度,對前40個HDLBP交聯k-mer組(左)和所有其他k-mer組(右)進行了該分析。d p兩兩Wilcoxon秩和檢驗的值z-前40個結合型高密度脂蛋白k-mer的得分,如(c). e交聯位點周圍+40/40 nt區域的HDLBP多價分析。為了評估T-C結合親和力作為HDLBP結合位點多價的函數,我們將40-nt區域內前十個富集的四聚體的多價分數分成五類(組大小從最高到最低分數組,n= 994,n= 973,n= 673,n= 1036,n= 1308).然后,針對所有五個類別繪制+40/40 nt區域的總歸一化T-C轉換信號。箱形圖的上下鉸鏈分別對應于第25和第75個百分點。上須和下須從鉸鏈延伸到最大值或最小值,分別不超過離鉸鏈1.5×四分位范圍。箱線圖的中線描繪了中值。f針對每個多價結合分析+40/40 nt區域內每個核苷酸位置的總T-C轉換百分比。顯示了具有最高多價分數的兩個倉并對應于(e). g比較CDS中差異定位的mRNAs之間的平均多價分數。一個陽性組(由前十個高密度脂蛋白交聯四聚體組成的四聚體組,UUCU)和一個陰性組(AAGU ),無高密度脂蛋白富集。這些四聚體組的出現在30-nt滑動窗口中計數,并計算每個轉錄本的平均得分。然后通過Wilcoxon秩和檢驗比較不同局部CD之間的平均分布。h重組GST-HDLBP片段(構建體A至D)和全長蛋白(FL)的表觀解離常數,示意性顯示,用于不同的RNA寡核苷酸,通過熒光各向異性結合試驗測定。測量到但無法確定的離解常數用“n.d .”表示,未測量到的相互作用用“—”表示。i具有不同數目的HDLBP結合四聚體的RNA寡核苷酸的熒光各向異性結合分析(左,H40-44)。將GST-HDLBP構建體B (KH5-9)與FAM標記的RNA寡核苷酸一起孵育,測量各向異性并進行KD由結合曲線確定(中間圖)。對于每種寡核苷酸,三個獨立的Kd值已確定。在以下方面的顯著差異Kd使用雙側評估值t-測試,并用星號(*P?<?0.01, *P?<?0.05). Data were presented as mean values?±? SD. ai源數據作為源數據文件提供。

我們詢問HDLBP結合是否由胞質和膜結合mRNAs的不同序列組成決定。為此,我們確定了全部3’UTR和CDS序列中所有可能的七聚體的頻率,并將其與高密度脂蛋白交聯七聚體的頻率進行比較。雖然最高的HDLBP交聯七聚體不是轉錄組中最常見的七聚體,但它們顯示出顯著更高的出現率(P= 2.7e-07),與胞質mRNAs相比(補充圖。3b).

因為HDLBP由15千赫的域組成26,33接下來,我們討論了它識別更長rre的可能性40。因此,對于長度在4和12個核苷酸之間的40個高度交聯的k-聚體,計算了膜結合和胞質mRNAs之間的頻率差異。交聯的k-mers通常在膜結合mrna序列中比在胞質mrna序列中更常見(圖。3c).此外,在最長的k-mers(10–12個核苷酸)中觀察到膜結合和胞質mRNAs之間的最大差異(圖。3c).因此,與胞質mrna相比,膜結合的mrna含有數量顯著更高的更長的高親和力結合HDLBP的RREs(圖。三維(three dimension的縮寫)).另一方面,交聯k-mers的出現在CDS和胞質mRNAs的3’UTR之間是可比較的(補充圖。3c,d),并且對應于這兩個轉錄物區域之間的HDLBP交聯的均等分布(圖。2c).總之,HDLBP與膜結合mrna的CDS的特異性結合至少部分可以用膜結合mrna和胞質mrna的k-mer組成的差異來解釋。

高親和力的多價HDLBP相互作用在膜結合的mRNAs中更頻繁地形成

由于大量的KH結構域,我們接下來推斷HDLBP可以識別與未結合的核苷酸間隔的RREs,產生多價相互作用。通過計算所有檢測到的交聯位置周圍40 nt區域中最頻繁交聯的四聚體的頻率(補充圖。3f),我們發現具有最高四聚體頻率的區域也顯示了這些區域內的最高交聯值(圖。3e).因此,高度多價的HDLBP結合位點也導致了高親和力的相互作用。此外,具有最高多價的區域內的平均位置交聯信號顯示,交聯的上游(13個核苷酸)和下游(+16個核苷酸和+20個核苷酸)的幾個位置發生了特異性交聯(圖。3f).因此,高親和力的HDLBP位點包含3-4個RNA元件,相隔幾個核苷酸,產生長度約為40 nt的結合位點。值得注意的是,多價相互作用分別導致膜結合和胞質mRNAs的CDS和3’UTR的高親和力相互作用(補充圖。3e).

為了探索膜結合和胞質mRNA與HDLBP形成多價相互作用的潛力,我們接下來計算了mRNA序列的30-nt滑動窗口內四聚體的出現率。我們觀察到膜結合的CDS中高密度脂蛋白交聯四聚體的局部頻率顯著高于胞質mRNAs(圖。3g).這種效應在一組未結合的四聚體中不存在,證實了膜結合的CDS含有高密度的局部HDLBP識別元件,這些元件引起多價相互作用。

為了更詳細地確定RNA底物特異性,我們表達并純化了含有不同KH結構域的重組全長HDLBP (FL)和蛋白變體(A–D )(圖。3h和補充圖。3i).使用熒光各向異性分析,我們確定了各自蛋白質RNA底物組合的表觀解離常數(Kd ),總結于圖。3h。全長的HDLBP與TFRC mRNA的區域(TFRC_1和_2)具有高親和力,這些區域是根據我們的PAR-CLIP數據選擇的。一個TFRC位點(TFRC_1_mut)的突變降低了結合。使用人工序列,我們可以顯示HDLBP與CCU-和CUU-寡聚物強烈相互作用,而與CAA寡聚物的親和力降低了約10倍。此外,HDLBP雖然親和力降低,但仍與18 S rRNA的ES6區結合。有趣的是,包含KH結構域5至9的HDLBP構建體B與測試的mRNA和18S rRNA序列的親和力與全長蛋白幾乎相似,這表明HDLBP的中心部分對于識別和與不同RNA底物的相互作用很重要。與全長HDLBP相比,5 C-末端KH結構域HDLBP顯示出與TFRC mRNA區域的結合減少。對于N-末端HDLBP片段A (KH0-KH4 ),我們無法識別高親和力RNA底物。

為了了解多價相互作用對HDLBP結合親和力的影響,我們接下來使用在一個較長的(34 nt)序列中具有不同數量的結合四聚體基序的RNA分子進行了體外HDLBP結合分析(圖。3i).我們確定含有三個HDLBP結合的四聚體(CUUC或UCUU)的合成RNA分子的Kd值明顯低于僅含有兩個HDL BP結合的四聚體的合成RNA分子。因此,HDLBP (KH5-9)對具有更高多價潛力的RNA具有約3-5倍的親和力。這些發現有力地支持了我們從PAR-CLIP分析中得出的結論,并證實了HDLBP通過多價相互作用以高親和力與長RNA區域結合。

HDLBP與翻譯裝置相互作用

由于HDLBP顯示了與膜結合mrna的CDS的特異性相互作用,我們接下來探索了它在ER靶向mrna的翻譯調控中發揮作用的可能性。HDLBP PAR-CLIP顯示與18S rRNA結合,兩個主要結合位點位于擴增片段6SB和螺旋16(圖。4a).這些位點可能在翻譯起始和延伸中起調節作用41,42因為它們接近真核起始和延伸因子(EIF4A、EIF4G1和EEF2)的結合位點(補充圖。4a).接下來,我們研究了HDLBP與信號識別顆粒(SRP)的7SL RNA成分的結合,SRP是新生多肽相關復合物協同翻譯靶向內質網膜所需的RNP。在7SL RNA中,我們觀察到與其他RBP(ire 1、SSB和MOV10)的結合模式不同的HDLBP接觸(圖。S4B).HDLBP交聯位于大(S)結構域的螺旋(5d–f,6,8a)和小Alu區域的不成對尿苷處(補充圖。4c).SRP占總T-C交聯的百分比與其他已知或預期的7SL RNA相互作用劑(IRE1和SSB)相當,比MOV10高約10倍,mov 10不強烈結合7SL RNA(補充圖。4d).總之,HDLBP與核糖體的40S亞單位在靠近SRP接觸位點的位置相互作用(圖。4b).

圖4: HDLBP與翻譯裝置相互作用。
figure 4

a在rRNA前區域檢測到PAR-CLIP覆蓋和交聯。為了比較,包括了IRE1 PAR-CLIP的結果。擴展段位置用綠色表示。b將人類80S核糖體(PDB: 4V6X)和SRP-核糖體復合物(PDB: 3JAJ)的結構并列,并繪制了HDLBP rRNA和7SL RNA交聯核苷酸的圖譜(用紅色表示)。c用FLAG/HA-HDLBP作為誘餌進行RNA免疫沉淀。通過qRT-PCR檢測共沉淀的RNA。計算四次重復的平均富集倍數(抗-FLAG對IgG對照),誤差棒表示標準偏差。顯示了7SL RNA、IGF2R、YWHAZ、CD46和ATP1A1的結果,以及作為陰性對照的mtDNA編碼的mRNA (MT-CO1)。dBirA-FLAG-HDLBP附近蛋白質的BioID分析。根據平均LFQ(Dox樣品的三個重復)對前60個富集的蛋白質(LFQ(Dox)對LFQ(noDox) >3)進行排序。圓點的大小對應于加濃值。e249個富集BioID蛋白的基因本體富集分析。調整過的p顯示了前五個豐富類別的值。fFLAG/HA-HDLBP與抗FLAG或IgG抗體共免疫沉淀。輸入裂解物(0.25%)和洗脫物(19%)的Western分析按指示用抗體進行。af源數據作為源數據文件提供。

為了確保這些接觸來自穩定的相互作用,我們通過RNA免疫沉淀(RIP)實驗證實了各種HDLBP RNA靶標(圖。4c).結果與PAR-CLIP實驗的結論一致,7SL RNA顯示中度富集,而幾種膜結合mRNA(yw HAZ,ATP1A1,CD46和IGF2R)顯示高度富集,而mtDNA編碼的mRNA (MT-CO1)沒有顯示富集。這些結果支持了HDLBP與PAR-CLIP鑒定的RNA種類形成穩定相互作用的結論。

為了通過正交方法驗證與翻譯裝置的相互作用,我們接下來使用BioID分析了HDLBP近端蛋白43在表達與混雜生物素連接酶BirA*融合的HDLBP的HEK293細胞中進行的接近標記試驗(補充圖。1d).我們通過RIP證實BirA*-FLAG-HDLBP也與我們先前檢測到的由FLAG/HA標記的HDLBP結合的幾個轉錄物結合(補充圖。4f).高密度脂蛋白近端蛋白的可重復性鑒定(補充圖。4e,g和補充數據4)與之前發表的BioID實驗重疊約50 %(補充圖。4h)44(圖。4d,e).我們發現頂部富集的蛋白質參與翻譯,包括翻譯起始因子(EIF4G1、EIF4B、EIF5和EIF4E2)(圖。4d,e和補充圖。4i)、伴侶蛋白和伴侶蛋白(HSPA1A、HSPA8和CCT8)、小亞基(SSU)的SRP成分(SRP68)和核糖體蛋白(RPS3A和RPS10)。我們通過正交抗FLAG免疫共沉淀實驗驗證了潛在的SSU相互作用,并發現免疫共沉淀物含有RPS6的SSU成分,但含有非常少量的RPL7(圖。4f).這一發現與通過PAR-CLIP和HDLBP結合18S rRNA序列檢測到的特異性18S rRNA交聯一致,如圖所示。3h??傊?,這些結果表明HDLBP與包括SRP在內的翻譯裝置相互作用,并位于核糖體相關因子附近。

高密度脂蛋白促進內質網膜的翻譯

基于以前的發現45,46,47,48,49以及在我們的研究中觀察到的HDLBP與膜結合mRNAs的CDS和核糖體的特異性相互作用,我們接下來研究HDLBP在ER相關翻譯中的功能。因此,我們通過產生兩個CRISPR/Cas9 HDLBP敲除(KO)細胞系,測量了HDLBP存在和不存在時的主動翻譯過程(圖。5a).HEK293 HDLBP敲除細胞沒有顯示明顯的生長缺陷,并且ER的電子顯微鏡成像顯示沒有形態學變化(數據未顯示)。為了量化KO和野生型(WT)條件下的翻譯效率,我們生成了核糖體圖譜數據集,其顯示了高閱讀周期和CDS中占優勢的框內P-位點覆蓋(補充圖。5a、b).由于這個數據集是從未分離的細胞中獲得的,我們詢問我們的實驗是否充分地捕獲了內質網結合的mRNAs上的核糖體足跡。正如預期的那樣,我們在起始密碼子下游區域觀察到含SP和TM的mRNAs的低足跡密度,直到來自核糖體的兩種靶向信號出現(補充圖。5c),證實該數據以接近核苷酸的分辨率恢復了ER結合的核糖體復合物。

圖5: HDLBP促進ER翻譯和分泌及跨膜蛋白的合成。
figure 5

aHEK293親代和HDLBP KO細胞中核糖體圖譜實驗的示意圖。Western分析顯示KO細胞中缺乏HDLBP。b膜結合的HDLBP靶mRNAs根據它們在CDS中的交聯信號分成三個相似大小的組(在括號中表示)。比較各組間翻譯效率的差異(HDLBP KO對WT)。使用雙側Wilcoxon秩和檢驗來檢驗顯著性。cHEK293親代和HDLBP KO細胞中新合成蛋白質的pSILAC分析。SILAC重對中比率(H/M)反映了HDLBP KO后蛋白質合成的變化,并在膜組分中定量?;诘鞍踪|在CDS中的交聯信號(在括號中表示),蛋白質被分成三個大小相似的組。使用雙側Wilcoxon秩和檢驗比較各組之間的SILAC比率。d基于蛋白的PAR-CLIP信號和膜定位(在括號中表示),蛋白被分成三個大小相似的組。使用雙側Wilcoxon秩和檢驗比較各組之間的SILAC比率。e親代和HDLBP KO細胞用分泌的高斯亞熒光素酶(Gluc)構建體。在培養基中對Gluc活性進行定量,并標準化為細胞內螢火蟲熒光素酶(Fluc)活性。四個重復實驗(R1-R4)中的每一個都進行了五次技術重復。數據以平均值±標準差表示。f親代和HDLBP KO細胞被轉染分泌型堿性磷酸酶(SEAP)構建體。在培養基中定量SEAP信號,并標準化為細胞內螢火蟲熒光素酶(Fluc)活性。每個實驗進行五次技術復制。數據以平均值±標準差表示。g穩定轉染過表達高密度脂蛋白(OE)構建體的A549細胞的Western分析。h在具有不同HDLBP蛋白水平(KO敲除,WT野生型,HDLBP/OE過表達)的HEK293和A549細胞中測量了相對于Fluc的SEAP活性。實驗進行五次,至少五次技術重復。數據以平均值±標準差表示。i在HEK293 HDLBP敲除(KO)與親代(WT)細胞之間,比較了靶向信號(信號肽和跨膜螺旋)周圍的核糖體P-位點覆蓋率。p-位點的覆蓋率與每個mRNA密碼子20-40的覆蓋率成比例。使用5 nt的滾動平均值來平滑輪廓。給出了分析的mRNAs的絕對數量,中間信號肽和第一次跨膜螺旋長度用垂直虛線表示。ai源數據作為源數據文件提供。

為了解決HDLBP KO翻譯效率的差異,我們比較了多組膜結合mRNAs(補充數據5),根據CDS中高密度脂蛋白交聯鍵的數量進行分類。在CDS中具有最大數量的HDLBP交聯的mrna中觀察到翻譯效率的最高下降,這表明HDLBP與膜結合mrna的相互作用促進了翻譯(圖。5b)但不影響ER mRNA的定位(補充圖。5d).我們通過在細胞培養中使用氨基酸脈沖穩定同位素標記(pSILAC)來量化蛋白質合成,從而驗證了這些發現50結合亞細胞分級分離(補充數據6).缺乏HDLBP通常導致由膜結合mRNAs編碼的蛋白質合成減少(圖。5c)并且降低的程度依賴于HDLBP交聯信號的水平(圖。5d和補充圖。5e).因此,HDLBP對于其靶mRNAs的有效蛋白質合成是必需的。由于內質網膜是分泌蛋白翻譯的主要場所,我們接下來詢問HDLBP是否影響它們的分泌。為此,我們表達了分泌型高斯亞熒光素酶(Gluc)和堿性磷酸酶(SEAP ),并對培養基中的酶活性進行定量。Gluc和SEAP活性在HDLBP KO后顯著降低了20-40 %,表明HDLBP缺失減少了兩種報告蛋白的分泌(圖。5e,f和補充圖。5f).

由于HDLBP的減少減少了分泌,我們接下來測試了HDLBP過度表達的影響。為此,我們將FLAG/HA-HDBLP瞬時轉染入HEK293和HEK293 HDLBP KO細胞。我們還使用攜帶HDLBP的piggybac轉座子在A549細胞中穩定過表達HDLBP(圖。5g).

為了測試對分泌的影響,我們將SEAP報道基因構建體轉染到具有不同HDLBP表達水平的HEK293和A549細胞中(圖。5h).正如預期的那樣,在HEK293和A549細胞中高密度脂蛋白的敲除減少了SEAP的分泌,而在高密度脂蛋白敲除細胞中高密度脂蛋白的過表達挽救了SEAP的分泌,使其恢復到野生型細胞中觀察到的水平。有趣的是,將HDLBP重新導入HEK293和A459細胞,分別導致分泌增加約1.15倍和2倍(圖。5h)證實了HDLBP表達水平直接影響SEAP分泌的程度。

接下來,我們研究了高密度脂蛋白的缺失是否會影響核糖體在膜結合mRNAs上的位置。為此,我們展示了已知目標信號周圍的覆蓋范圍(圖。5i和補充圖。5g)并發現缺乏HDLBP導致編碼SPs或第一個TM結構域的區域下游的核糖體密度較低。這表明HDLBP有助于核糖體伸長停滯,這是共翻譯靶向和新生肽有效易位所必需的。

HDLBP與mRNAs和tRNAs中含CU/UU的密碼子交聯,解碼這些密碼子

我們接下來研究了我們的核糖體圖譜數據集,以量化野生型和KO型條件下每個密碼子的核糖體占用率。雖然我們發現在HDLBP KO后,幾個密碼子(包括UUC/Phe、UUU/Phe、CUC/Leu和CUU/Leu)平均被核糖體和P-位點和E-位點占據的稍多,但這種增加沒有統計學意義。因此,在KO條件下,全球核糖體停滯可能是可測量的,但可能是HDLBP耗竭的間接效應。密碼子中標準化HDLBP PAR-CLIP信號的分析(補充圖。6a),確定了相同的密碼子(UUC/Phe、CUC/Leu和CUU/Leu)是結合度最高的。

此外,我們通過PAR-CLIP富集分析了HDLBP與tRNA的結合,以及每個tRNA交聯位置的T-C轉換特異性(補充數據7)并觀察到4個亮氨酸同型trna在HDLBP結合庫的前15個富集trna中(圖。6b).它們的交聯位點位于可變和D環(圖。6c和補充圖。6b)并對應于HDLBP mRNA結合基序(UCUUC)。有趣的是,由這些tRNAs解碼的密碼子在HDLBP缺失的細胞中更容易被占據(圖。6a),表明HDLBP tRNA結合可能通過促進tRNA再循環或減少tRNA從核糖體擴散來實現更有效的tRNA解碼,如前所述34.

圖6: HDLBP與tRNAs交聯,解碼含CU/UU的密碼子。
figure 6

aHDLBP KO與WT中P-位點(頂部)和E-位點密碼子(底部)的密碼子頻率差異。計算四次重復的平均密碼子偏移(顯示了平均標準偏差)。btRNAs在HDLBP PAR-CLIP中的富集及其結合位點。tRNA中的T-C轉換被標準化為總tRNA豐度,并從最高值到最低值排序(從左到右)。對于每個T-C轉換,我們顯示了其轉換特異性(T-C轉換與總閱讀覆蓋率)。描繪了兩個PAR-CLIP生物重復SD的平均值。還顯示了總log2轉化的tRNA豐度和密碼子使用(頂部)。c(左)與tRNA Leu-UAG比對的瀏覽器表示。D-loop和V-region中的T-C轉換針對HDLBP PAR-CLIP數據集。第二個軌跡顯示總RNA樣品的覆蓋范圍。(右)HDLBP交聯尿苷表示二級tRNA結構。

缺乏HDLBP導致較低的增殖和腫瘤形成能力

HDLBP在ER翻譯和分泌中的功能可以影響有絲分裂原、生長因子、受體和細胞外基質的產生,從而極大地影響細胞增殖、分化、遷移和侵襲。為了測試這一點,我們在肺腺癌(LUAD)衍生的細胞系A549中建立了CRISPR/Cas9誘導的HDLBP KO。在2D培養的A549細胞中,HDLBP缺失顯著降低了粘附生長(40-50 %)(圖。7a).同樣地,HDLBP KO干擾A549細胞的2D遷移,如劃痕遷移分析中傷口閉合嚴重減少所示(圖。7b).由HDLBP結合的TFRC mRNA編碼的跨膜糖蛋白CD71的表面表達(圖。3h)在HDLBP KO時減少(圖。7c和補充圖。7a,b).相反,A549細胞中高密度脂蛋白的過度表達導致傷口加速愈合(圖。7d).總的來說,這些發現表明HDLBP實質上影響腫瘤細胞的致癌特性。為了在體內測試這一點,用iRFP(紅外熒光蛋白)穩定轉導親代和HDLBP KO A549細胞,并且將活細胞皮下(皮下)注射入胸腺(FOXN1女/女)裸鼠來監測腫瘤的起始和生長(圖。7e).注射后立即進行iRFP的非侵入性近紅外成像,驗證了兩種細胞群的同質皮下應用(補充圖。7c注射后0天)。引人注目的是,高密度脂蛋白缺失嚴重降低了腫瘤的發生和生長(圖。7e和補充圖。7c).與在所有八只分析動物中形成腫瘤的親代細胞相反,HDLBP KO細胞僅在八只動物中的三只中形成可觸知的腫瘤(補充圖。7c).因此,高密度脂蛋白缺失顯著降低了腫瘤體積和最終腫瘤質量(圖。7f),說明HDLBP本質上參與了腫瘤的啟動和生長。

圖7: HDLBP是腫瘤異種移植物生長和形成所必需的。
figure 7

aA549親代或HDLBP KO細胞的相對融合、生存力和DNA含量。顯示了代表性的匯流面罩(左圖)。不成雙的t-檢驗用于檢驗顯著性(***p?<?0.001). bWT或HDLBP KO細胞的傷口愈合。損傷后對傷口愈合情況監測20小時(右圖)。損傷后20小時計算傷口密度(中圖)。顯示了代表性的匯流面罩(左圖)。不成雙的t-檢驗(左)和雙向ANOVA(右)用于檢驗顯著性(均***p?<?0.001). cWT或HDLBP KO細胞的CD71表面表達。通過流式細胞儀實驗測定CD71的平均熒光強度(MFI)。d用強力霉素誘導的HDLBP過表達穩定轉染的A549細胞的傷口愈合(見圖。5g).損傷后20小時計算傷口密度(右圖)。顯示了代表性的匯流面罩(左圖)。不成雙的t-檢驗用于檢驗顯著性(***p?<?0.001). e小鼠注射實驗示意圖。將WT或HDLBO KO A549細胞注射到無胸腺裸鼠的右側和左側。在注射后的21天內,跟蹤八只小鼠的腫瘤形成。f腫瘤體積(毫米3)在注射后7、14和21天進行定量(左圖)。顯示了由KO或WT細胞形成的log2轉化的腫瘤體積的箱線圖。不成對的雙面t-測試用于比較。括號中給出了每組可觸及腫瘤的數量。注射后21天對腫瘤重量進行定量(右圖)。顯示了由KO或WT細胞形成的腫瘤重量(以mg計)的箱線圖。不成對的雙面t-測試用于比較。在沒有腫瘤的情況下,重量標為0。箱形圖的上下鉸鏈分別對應于第25和第75個百分點。上須和下須從鉸鏈延伸到最大值或最小值,分別不超過離鉸鏈1.5×四分位范圍。箱線圖的中線描繪了中值。gHDLBP KO細胞腫瘤中下調和上調mRNAs的基因本體富集分析。調整過的p顯示了前六個豐富類別的值。h如HEK293 RNA-seq分級實驗中所確定的,比較了膜結合和胞質mrna之間的倍數變化差異(HDLBP KO與WT腫瘤)。使用雙側Wilcoxon秩和檢驗來檢驗顯著性。ad數據以平均值±標準差表示。ah源數據作為源數據文件提供。

為了確定HDLBP KO如何影響基因表達,在最終腫瘤中通過RNA測序監測RNA豐度(補充圖。7d).在缺乏HDLBP的情況下,大量的mRNAs被發現上調(n= 1039)和下調(n= 700),表明HDLBP對基因表達有很大的影響,這可能是由于細胞信號傳導和腫瘤-基質串擾顯著受損(補充圖。7e和補充數據8).引人注目的是,被HDLBP KO減少的mRNAs蛋白產物富含分泌蛋白(如膠原蛋白和基質金屬蛋白酶,MMP2),這些蛋白在生物過程中起作用,如“細胞外基質組織”、“細胞粘附”和“組織發育”(圖。7g).這些發現支持了這樣的觀點,即HDLBP影響蛋白質輸出、表達和/或轉錄本編碼因子的更新,這些因子主要參與調節腫瘤-基質景觀的組成和相互作用。為了評估HDLBP對去調控mrna的直接控制,我們比較了HEK293細胞中根據PAR-CLIP信號分類的mrna亞組在WT和KO異種移植腫瘤之間的倍數變化。我們發現HDLBP的mRNA表達的變化靶向mRNA(補充圖。7f)和膜結合mRNAs(圖。7h)在缺乏HDLBP的異種移植物中比在非靶或胞質mRNAs中顯著降低。雖然HDLBP是否通過調節er相關的翻譯來影響mRNA的更新還有待研究,但這些發現表明,除了間接調節基因表達外,HDLBP還可能通過調節ER相關的mRNA翻譯來直接影響mRNA的豐度??傊?,目前的發現提供了強有力的證據,證明HDLBP是腫瘤進展的重要調節劑,影響分泌因子、受體和細胞外基質成分的表達,參與調節腫瘤的起始和進展。

討論

在這篇文章中,我們描述了HDLBP在ER翻譯環境中的功能。而約80%的膜結合mRNAs被發現是HDLBP的高親和力底物(圖。1e),它們也顯示了CDS中的主要結合(圖。1c,2b).相比之下,只有約40%的所有胞質mRNAs含有HDLBP結合位點,但顯示出明顯較低的親和力,并且更隨機地分布在CDS和3’UTRs之間(圖。2b).對ER靶向的和細胞溶質的mrna的一級序列的研究顯示,HDLBP結合的含銅基序在膜結合的mrna中更常見(圖。3a),這也顯示了疏水性氨基酸的高密碼子頻率,例如通常存在于信號肽和跨膜螺旋中的Leu (CUC和CUU)、Ile (AUC)、Phe (UUC)和Val (GUC)51.

雖然先前報道的CHHC/CHYC結合基序35與我們的發現相匹配,我們進一步發現證據表明,在er結合的mRNAs中,長度達12 nt的較長HDLBP結合基序的頻率高于較短基序的頻率(圖。3c,d).因此,HDLBP可能通過利用其不同的序列組成進化為特異性識別膜結合mRNAs。多個KH結構域可能允許HDLBP通過其與長的異質RREs和/或多部分基序的相互作用識別ER結合的mRNA,產生多價的高親和力結合區域,如對其他RBP所觀察到的28,52,53,54。因此,我們對高多價高密度脂蛋白位點進行了定量,發現它們與高結合親和力相關,長度約為40 nt,平均含有3-4個含UC/CU的四聚體,位置相隔幾個核苷酸。這可能反映了HDLBP蛋白結構中的3-4個功能域模塊與多個RREs的結合。使用體外結合試驗(圖。3i),我們證實了這些觀察結果,并得出結論,多價相互作用確實導致了高密度脂蛋白對長RNA結合區域的更高親和力。進一步的研究將提供關于哪些結構域或它們的組合負責長多價位點的識別和含HDLBP的mRNPs的形成的見解。最近鑒定的含C/U重復的分泌基序17支持酵母mRNA中長功能序列的存在,這是分泌編碼蛋白所必需的,并且很可能代表HDLBP酵母直系同源物Scp160p的RNA結合位點。

此外,我們報道了HDLBP與ER相關的mRNAs相互作用,并促進它們的翻譯,導致合成蛋白的分泌增加(圖。5),這與之前的發現一致34,35。因為我們不僅在ER靶向mrna中,而且在沒有已知或預測靶向信號的膜定位mrna中發現了高親和力的HDLBP結合位點(圖。1d),HDLBP可能對SRP依賴性和非依賴性mRNAs的有效翻譯都有顯著貢獻8,9,10,11,12。哺乳動物細胞中SRP依賴性和非依賴性mRNAs的分析將有助于未來的研究。

此外,我們發現缺乏HDLBP導致靶向信號周圍核糖體延伸停滯減少(圖。5g).這一過程是新生肽有效靶向和轉運到內質網腔,以及防止錯誤折疊、聚集和內質網相關降解所必需的55。因此,高密度脂蛋白介導的局部核糖體減速可能促進由高密度脂蛋白結合區編碼的蛋白質結構域的靶向、移位和精確折疊。這種可能性得到了檢測到的h16和ES6SB 40S HDLBP相互作用的有力支持,它們靠近EEF2和EIF4G2結合位點41并且可以影響核糖體延伸停滯。此外,在7SL RNA區域檢測到低親和力的HDLBP接觸,這是延長停滯期間GTP水解延遲和膜靶向活性所必需的56也支持這個觀點。最后,我們確定了與HDLBP密切相關的關鍵伴侶蛋白和伴侶蛋白,支持其在蛋白質折疊中的作用,正如先前對其酵母直系同源物的建議36.

從機制上講,我們認為HDLBP通過與mRNA和小核糖體亞單位以及其他核糖體相關因子結合而與翻譯裝置相互作用。高親和力的mRNA結合有助于伸長停滯的胞質RNC的形成,允許它們有效定位于內質網膜,跨位點轉移,和/或使新生肽能夠正確折疊。由于HDLBP最有可能與延伸核糖體下游的mRNA結合,它可能通過核糖體碰撞與mRNA隔離,可能通過tRNA和/或核糖體ES6SB依賴機制,這仍有待闡明。我們推測HDLBP僅在最初的翻譯過程中與mRNA結合,然后被去除。這一步驟可以使mRNA分子定位于內質網,在內質網折疊機制和聚集質量控制的存在下,可以進行額外的翻譯。將來,在翻譯的不同階段,高密度脂蛋白與mRNA、rRNA和tRNA結合的序列應該被闡明。

在缺乏HDLBP的情況下,我們也檢測到P-和E-位點的核糖體占用率增加。由于這種增加是適度的,沒有統計學意義,這可能是HDLBP KO間接效應的結果。然而,一些研究表明E-位點可能作為核糖體延伸動力學的傳感器57E位點的占據可能直接影響翻譯的保真度和核糖體的轉位58,59這可能是HDLBP促進翻譯延伸的另一種可能機制。

總的來說,我們的結果指出了HDLBP在ER翻譯中的一般功能。雖然這對每個細胞都很重要,但我們預計這種表型在特化分泌細胞類型(如成纖維細胞、胰腺和免疫細胞)中最為突出。為了支持這一觀點,HDLBP mRNA表達,以及可能的HDLBP蛋白水平在分泌細胞中顯著升高(補充圖。7g),最突出的是成纖維細胞,成纖維細胞是通過產生和重塑細胞外基質來協調細胞外景觀的關鍵。此外,HDLBP失調會引起深遠的后果和疾病表型的調節,如病毒復制受損24動脈粥樣硬化斑塊形成35和自閉癥60。最后,本研究的結果強調了在腫瘤發展過程中高密度脂蛋白與肺部腫瘤細胞的顯著關系,并表明針對高密度脂蛋白的治療干預可能代表了一種以前未被認識到的抑制肺部腫瘤生長或其他惡性腫瘤的策略。在未來,HDLBP對腫瘤生物學調節作用的進一步含義需要探索。


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