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用于基于活顯微鏡的分析的克隆多路復用的可視條形碼

 二維碼
發表時間:2022-05-25 15:02作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

雖然使用DNA條形碼對樣品進行多路復用徹底改變了生物醫學發現的步伐,但基于實時成像的應用的多路復用受到了熒光蛋白數量的限制,這些熒光蛋白可以使用普通顯微鏡設備進行解卷積。為了解決這一限制,我們開發了可視條形碼,通過靶向特定亞細胞位置的不同熒光蛋白來區分單細胞的克隆身份。我們證明了這些條形碼的去卷積是高度準確的,并且對許多細胞擾動是魯棒的。然后,我們使用可視條形碼,通過將不同活報告子的12個克隆混合到一個群體中,生成“信號組”細胞系,允許隨時間以克隆分辨率同時監測12個信號分支的活性。使用“信號組”,我們確定了平衡生長和增殖的兩組不同的信號通路,強調了生長動態平衡作為癌癥信號傳導的中心組織原則的重要性。在活體成像應用中,在體外和體內對樣品進行多路復用的能力可以更好地對復雜的生物系統進行高含量表征。

介紹

多重樣本的能力徹底改變了科學和醫學實踐?;驐l形碼應用實現了前所未有的多路復用,隨后在scRNA-Seq或功能性CRISPR/shRNA/開放閱讀框(ORF)篩選等應用中并行處理和分析幾十到幾十萬個樣本。相比之下,在基于圖像的屏幕領域,高階復用受到可用普通顯微鏡設備實際分離的少量通道的限制。為了解決這個問題,我們開發了可視條形碼,使基于顯微鏡的應用能夠復用,并使用它們來復用活細胞報告基因,以研究癌細胞中的信號通路動力學。

為了維持生長,單個細胞必須平衡一個整合來自眾多信號分支的信息的網絡。在癌癥中,主要信號通路的遺傳和非遺傳改變與腫瘤的發生、發展和對抗癌治療的反應密切相關。還證明了這些改變中的許多可以歸類為十幾個信號通路,它們一起調節核心細胞過程,如細胞命運、細胞存活和基因組維持1,2.

為了促進對癌癥信號傳導的理解,先前的研究已經開發了基因標記的活性報告基因,即響應特定信號傳導活性而表現出豐度或定位變化的熒光蛋白3,4。與終點分析不同,終點分析需要結束實驗以測量表型,這些報告分子有助于以單細胞分辨率揭示活細胞中單個信號轉導途徑分支的復雜動力學。然而,由于很難復用熒光報道分子,這些獨立的信號分支之間的相互依賴性仍然沒有得到很好的研究。

在這項研究中,我們描述了視覺條形碼的發展和應用,這是一種能夠實現活細胞成像應用的技術。視覺條形碼被用作混合群體中單細胞克隆身份的標簽。為了促進對癌癥信號通路及其串擾的理解,我們使用視覺條形碼來復用主要信號通路的12個活報告子,生成了一個我們稱為“信號組”的實驗系統。

使用信號組,我們研究了癌細胞中12個信號轉導途徑的協同(多重)動力學,這些信號轉導途徑受到了充分表征的化學干擾物的挑戰。我們的結果表明,多路復用12條報告線不僅增加了通量,還消除了高通量藥物篩選中與孔間差異相關的噪音。令人驚訝的是,我們的結果也確定了以前沒有描述過的癌癥信號的二元劃分為兩個不同的簇。

為了維持體內平衡,增殖細胞需要協調細胞分裂速率和適當生物合成速率的機制。為了維持癌基因的增殖需求,癌細胞需要精確調節的生物合成速率5。如果細胞在連續的細胞分裂中質量沒有翻倍,細胞質量將逐漸減少。相反,超過細胞分裂速率的生物合成速率會導致細胞增大和衰老6,7,8。我們發現,由信號組系統識別的兩組信號通路代表了一種普遍的應激反應,這種反應與細胞平衡生長和增殖的需要相關。因此,在癌細胞系中實現信號組揭示了生長穩態作為癌癥信號傳導的中心組織原則的重要性,這一點以前沒有得到充分認識。

因此,我們的研究結果表明,信號組是一種強大的技術,可以幫助研究單細胞分辨率的信號通路動力學以及不同信號分支之間的相互連接。由于該系統是高度模塊化的,更換報告分子可以很容易地實現,從而允許研究生物學不同領域的許多其他問題。此外,可視條形碼可用于許多體外和體內應用,其中需要對多重細胞系進行可視解卷積。

結果

開發可視條形碼,實現實時成像應用的多路復用

為了構建可視條形碼,我們首先用慢病毒穩定感染A375黑色素瘤細胞系,該慢病毒含有融合到iRFP的核標記組蛋白2A(iRFP-H2A ),以精確區分細胞核和細胞質區室(圖。1A).接下來,使用iRFP-H2A癌細胞產生五個亞克隆,每個亞克隆都用青色熒光蛋白(CFP)標記,該蛋白用獨特的細胞定位序列標記,將CFP靶向到五個亞細胞位置之一:細胞核、內質網(er)、細胞質(nes)、過氧化物酶體(Peroxi)和全細胞(WC)(圖。1B).因此,CFP定位被用作可以區分克隆身份的可視條形碼。

圖1:為多路實時成像應用開發可視條形碼。
figure 1

A具有iRFP-H2A核標記的A375細胞系的代表性圖像。BA375細胞系中五種CFP定位的代表性圖像:全細胞(WC)、核輸出信號(NES)、細胞核、過氧化物酶體(Peroxi)和內質網(ER)。CA375細胞系中五個CFP定位的條形碼誤檢率(FDR)熱圖。DA375細胞系中使用的所有12種視覺條形碼的代表性圖像。E使用DMSO質控品處理的A375細胞系的所有12個可視條形碼的平均條形碼缺失率(n= 39).對角線上的數字代表每個條形碼的靈敏度。F顯示用DMSO對照處理的A375細胞系的所有12個視覺條形碼的缺失率的Violin圖(n= 39)或與藥物(n= 75).GI散點圖顯示了ImageStream系統根據熒光顏色和定位對9個具有可視條形碼的A375克隆進行的分離。通過定位的分離僅在GFP陽性克隆中得到證實(I). J來自所有九個克隆的ImageStream的代表性圖像。呈現來自每個克隆的兩個細胞。比例尺在(AB)是50米,英寸(D)100米及以下(J)7 m .本文提供了源數據。

為了測試視覺條形碼的準確性,我們使用相位對比以及iRFP和CFP通道分別對五個亞克隆中的每一個進行成像。然后我們使用細胞輪廓儀9以:(1)分割細胞,(2)識別細胞核和細胞質區室,以及(3)提取每個細胞的CFP通道中基于紋理、形狀和強度的特征(Sup代碼)。CellProfiler分析師10用于根據可視條形碼讀數對單細胞進行分類。在我們的實現中,我們使用70%的單元作為訓練集,剩余的30%作為驗證集。平均誤檢率(假陽性條形碼標簽)為1.15%,而漏檢率(假陰性率)為1.17%,分別代表非常高的精確度和召回率(圖。1C和補充圖。1A).最高的誤檢率和漏檢率都是在核定位和ER定位之間檢測到的,因此在額外的隨訪中不再優先考慮。

為了將視覺條形碼的維度擴大到12條形碼系統,我們將三種定位信號融合到四種熒光蛋白(CFP、BFP、GFP和YFP)中,產生了12種不同的視覺條形碼(圖。1D).條形碼數量的增加仍然保持了非常高的準確性,平均誤檢率為1.45%,漏檢率為1.34%(圖。1E和補充圖。1B).大多數檢測錯誤發生在具有相同熒光顏色的亞克隆之間,在全細胞和過氧化物酶體BFP之間檢測到的錯誤檢測率最高(圖。1E).為了探索系統在不同類型擾動下的穩健性,我們用75種藥物分別處理每個亞克隆(補充數據1).我們發現,在藥物治療48小時后,幾乎所有藥物的精確度和召回率仍然非常高,只有8種藥物(12%)的缺失率超過3%,其中5種強烈影響細胞增殖和生存能力。(圖。1F和補充圖。1B角).

請注意,進一步增加條形碼數量的一種選擇是將兩種條形碼蛋白結合到一個細胞中。通過使用四種熒光蛋白和五種定位,可以生成多達160種不同的視覺條形碼。事實上,我們能夠證明條形碼調用具有非常高的精確度和召回率,甚至當具有相同定位但不同顏色的條形碼被組合時(補充圖。1D).

最后,我們展示了當細胞懸浮時,使用Imagestream高分辨率顯微鏡和流式細胞儀系統也可以分離克隆(圖。1G–J).由于我們的系統缺少檢測YFP的激光,我們只復用了9個亞克隆。為了證明可視條形碼也可用于體內,我們混合了9個克隆,并將其植入裸鼠皮下。當腫瘤達到8 mm的直徑時,將其切除,解離成單細胞,并通過Imagestream系統進行分析,證明可以檢測到所有9個克隆(補充圖。1F–J).

產生“信號組”報告細胞系

為了產生信號組,我們組裝了12個先前發表的和充分表征的報告基因結構(補充圖。2A),每個都與不同的癌癥相關信號通路的活性相關。為了實現它們的多路復用,我們用mStrawberry熒光蛋白替換了12個報告載體中每個載體的原始標記熒光蛋白。我們使用了兩種不同類型的報告基因:通過特異性轉錄反應元件(TRE)驅動熒光蛋白表達的報告基因,或在上游信號激活時將熒光蛋白從細胞核轉移到細胞質的激酶易位報告基因(KTRs )(補充圖。2A).

然后我們用12個報道基因中的一個感染12個具有可視條形碼的A375亞克隆(圖。2A).接下來,我們驗證了單細胞衍生的報道基因亞克隆的增殖速率與親代細胞系的增殖速率沒有差異(補充圖。2B).我們還驗證了所有12個亞克隆與親代A375細胞系一樣對BRAF抑制劑vemurafenib敏感(補充圖。2C).最后,我們將產生A375信號體細胞系的所有12個亞克隆匯集在一起,并證明12個不同克隆的比例在培養48小時后保持恒定(圖。2B).

圖2:生成A375“信號組”報告細胞系。
figure 2

A用于產生A375信號體細胞系的12個克隆的圖示。A375細胞首先用iRFP-H2A感染以標記細胞核。然后,用12個可視條形碼產生12個克隆。最后,給每個克隆體添加一個不同的活報道分子。轉錄激活報道基因用金色表示,而易位報道基因用紅色表示。細胞核中的結合配偶體用紫色表示。B隨著時間的推移,DMSO對照孔中來自每個克隆的細胞的相對數量。C散點圖顯示了所有12個克隆在單獨生長或作為信號體細胞系的一部分生長時,對75種藥物的反應,報道分子活性得分之間的相關性。DFA375信號體細胞系對DMSO、vemurafenib (1 M)或曲馬替尼(0.125 M)的反應隨時間變化的報告子活性圖。藍色和紅色背景分別代表高于0.2或低于0.2的激活或抑制分數。每個報告者的平均細胞計數(DF)分別是:656、545和530個細胞。本文提供了原始數據。

單細胞測量的一個優點是,不僅可以表征擾動對群體平均的影響,還可以表征其對全部分布的影響(即,具有低、中或高信號活性的細胞的頻率)。為了量化報道活性分布的條件依賴性差異,我們使用了Kolmogorov–Smirnov(KS)檢驗,因為它是一種非參數檢驗,也可以檢測分布均值未反映的分布變化(補充圖。2D)11,12。為了增加KS分數,根據這些分布平均值的方向變化,給活動分數分配一個正號或負號。我們使用0.2的閾值來標記活性的顯著變化,因為它代表了我們的DMSO對照孔中0.5個百分點的報道活性(補充圖。2H).為了驗證報告分子的活性,我們首先對每個報告分子使用已知的陽性或陰性調節劑,證明報告分子的分數和預期的藥物效果之間存在完美的相關性(補充圖。2F).我們還將A375信號體細胞系活性分數與單獨測試時所有12個報道分子的活性進行了比較,發現兩者之間有很強的相關性(r= 0.75,P?<?10?16)(圖。2C).正如預期的那樣,我們還發現Vemurafenib和MEK抑制劑Trametinib,兩者都是MAPK途徑的抑制劑,對A375-Signalome細胞系具有高度相似的作用(圖。2D–F).最后,為了驗證我們的報告分子使用不同方法的活性,我們使用蛋白質印跡分析證明兩種技術之間完全一致(補充圖。2G).

信號傳導的多重、時間依賴性測量的一個優點是能夠區分直接和間接的藥物影響。例如,雖然MAPK抑制劑(vemurafenib和曲馬替尼)促進了在藥物治療1.5小時后觀察到的ERK信號的可檢測變化,但也觀察到了這些相同藥物對其他途徑的影響,盡管時間要晚得多(圖。2D–F).這與這些藥物對MAPK途徑的直接作用以及隨后其他途徑對抑制MAPK途徑的適應性反應是一致的。事實上,以前的報告已經描述了PKA的激活13,NFkB14,HIF15、和YAP/TAZ16并提示這些適應可能有助于抵抗MAPK抑制。此外,我們觀察到BRAF或MEK抑制后48小時視黃酸受體活性顯著上調(P值< 6 × 10?5).有趣的是,對黑色素瘤患者的三個獨立組群的檢查表明,如病理學家從表達數據計算的,具有高活性的RAR/RXR途徑的患者17,18總體存活率較高(補充圖。2I–K).因此,繼續并更好地探索RAR在黑色素瘤中的作用及其對治療的反應可能是有意義的。這些測量還證明了Signalome系統的效率和通量:使用一個384孔板,我們篩選了75種藥物(一式三份)和39種DMSO對照在多個時間點和單細胞分辨率下對12個信號分支的影響。因此,單個信號板提供了來自每個不同時間點的50萬個細胞的測量值。

為了證明可視條形碼和信號組系統可以很容易地應用于其他細胞系,我們使用PC9 EGFR突變的非小細胞肺癌細胞系和SK-MEL-5 BRAF突變的黑色素瘤細胞系產生了另外兩種信號組細胞系。我們能夠證明我們的條形碼精確度和召回率在這些細胞系中也非常高(補充圖。3A–D)并且可以檢測到兩種抑制劑對ERK的早期抑制,隨后是細胞系特異性適應機制。例如,A375黑素瘤細胞系中BRAF或MEK的抑制導致YAP/TAZ途徑的激活,而SK-MEL-5細胞系中BRAF/MEK抑制的效果導致YAP/TAZ途徑的抑制(補充圖。3E–H).在這里,我們再次發現PC9細胞中的EGFR抑制也驅動了RAR活性的上調。

信號傳導中的大規模相關性表明了一種不依賴于化合物的廣義反應

為了研究癌癥信號傳導中的相互依賴性,我們用422種充分表征的化學干擾物的文庫處理合并的A375信號組細胞系(補充數據2,補充數據3和補充圖。4A).在所有測試的化合物中,122種(28.9%)促進了至少一種報道的途徑的顯著變化(KS絕對分數> 0.2)(圖。3A,補充圖。4I,補充數據4和補充數據5).正如預期的那樣,具有相似靶點的不同藥物顯示了相似的報告基因對這些藥物的反應模式(補充圖。4B–G).

圖3:信號傳導中的大規模相關性表明了一種不依賴于化合物的普遍反應。
figure 3

A根據活性得分對122種活性藥物治療的A375信號組細胞進行無監督的分級聚類。由于技術錯誤,沒有對所有藥物測量Geminin報告基因,因此將其丟棄。來自所有12個報告者的結果可以在補充圖中看到。4I對于有Geminin數據的藥物子集。B散點圖顯示了用122種活性藥物治療48小時后p38和p53報道基因的活性之間的相關性。C顯示用122種活性藥物治療48小時后,不同A375信號組克隆之間成對皮爾遜相關性的熱圖。D提出具有不同機制的藥物如何匯聚成兩種主要信號狀態的模型。雖然每種藥物都有不同的靶標,但許多靶標影響相同的傳感機制,該機制后來控制p53-vs p38-信號狀態。本文提供了原始數據。

令人驚訝的是,除了靶特異性信號,報告分子活性分數的無監督聚類也表明了一個更高的結構,該結構將信號轉導信號分成三個聚類,其中兩個似乎是反相關的(圖。3A和補充圖。4I).簇A類化合物似乎全部激活PKA、AKT、ERK、p38和JNK途徑,同時抑制WNT、p53、NFkB、RAR、HIF和YAP \ TAZ而簇B包含協調相反反應的藥物。類別C包含不符合這種二分法的藥物。大量具有不同作用機制的藥物導致信號簇A和B,表明對藥物治療的協調反應涉及我們所有測量的信號分支,并且令人驚訝地獨立于藥物靶點。作為一個恰當的例子,圖。3B顯示了p53和p38活性之間的負相關,這種負相關在各種各樣的化學擾動中持續存在。降低p38活性的藥物與p53活性的相應增加相關,反之亦然(Pearson的r= ?0.517,P??<??2.2?×?10?16)(圖。3B).更一般地,當比較來自簇A的途徑和來自簇B的途徑時,藥物促進簇A或B內的途徑之間的正相關性(簇內相關性)和負相關性(簇間相關性)。為簡單起見,我們將這兩個集群稱為p38信號狀態(聚類A)p53信號狀態(聚類B)(圖。3A).

化學擾動可以通過同時影響一個以上的目標而產生相關的影響。然而,這種相關的影響應該是化合物特異性的,涉及不同化合物之間不同的靶親和力。相比之下,我們發現,在大量藥物中,相同的通路對是正相關或負相關的(n= 122)具有多個非常不同的目標。(圖。3B角).為了證明這種劃分不是細胞系特異性的,我們用247種藥物處理PC9信號組細胞系,發現非常相似的分叉為兩個反相關的通路簇(補充圖。4H和補充數據6).因此,問題如下:如此多種多樣的擾動,每一種都與不同的目標有關,怎么可能只集中到兩個主要結果上呢?我們推斷,將信號通路分成兩個簇表明了一個調控過程,該過程是我們測量的所有信號分支的共同上游(圖。三維(three dimension的縮寫)).

信號的大規模相關性存在于治療前,并隨著時間的推移由多種藥物增加

為了深入了解這種上游調節過程的本質,我們首先進行了時間過程測量,以詢問藥物治療后多久兩兩相關變得明顯?我們發現,在藥物治療后的48小時內,通路活性的成對相關性變得越來越顯著(圖。4A灣).藥物治療后兩種信號狀態的分離也可以從時間過程測量的視覺檢查中明顯看出(圖。4C–H).報告分子對化學性質不同且與不同靶標相關的六種代表性藥物的反應軌跡表明,盡管三種藥物促進了p38信號狀態(圖。4C–E),其他三個激活p53信號狀態(圖。4F–H).總之,這些結果通過顯示各種不同的藥物(每種藥物與不同的靶標相關)匯聚促進兩種主要的信號狀態結果,證明了信號通路的二元劃分。

圖4:藥物治療增加了途徑活性之間的相關性。
figure 4

A在用122種活性藥物治療之前和之后的多個時間點,A375信號體細胞系中p38和p53報告基因的活性分數散點圖。每個點代表一種不同的藥物。皮爾遜的r描繪了每個時間點。B在用122種活性藥物治療之前和之后的不同時間點,計算A375信號組細胞系中每對通路的皮爾遜相關系數。每個數據點代表所有122種活性藥物的一對給定途徑的相關值。p38和p53途徑的活性分數之間的相關性用紅圈標記。CH顯示了六種代表性藥物治療的兩種信號狀態中每一種的所有報告基因的局部加權平滑(Lowess)回歸,每種治療與不同的藥物靶點相關。而三種藥物驅動p53信號狀態(CE),其他三種藥物驅動p38信號狀態(FH).粗線(紅色和藍色)和灰色套管分別代表平均值和+/-SEM。本文提供了原始數據。

這些結果表明,p38和p53信號狀態是由一個過程介導的,該過程響應藥物治療,隨時間逐漸增加其影響或活性。由于藥物治療很可能只是促進了一個已經存在的過程的活性,我們很好奇為什么圖。3C似乎不存在于未受干擾的細胞中(圖。4B)?一種可能性是,在藥物治療之前,信號通路同時受到幾種相互競爭的調節需求的影響,每種需求都朝著不同的方向發展。根據這一解釋,藥物治療通過增加一個特定調節過程(最有可能是應激反應)的相對權重來促進相關信號傳遞,從而其效果不再被競爭性影響平均化。這個模型提出了一個可檢驗的假設:如果測量值對獨立存在的相關性進行標準化,那么在未處理的細胞中,12個途徑的二元劃分應該變得明顯。

為此,我們使用了主成分分析(PCA),這是一種將數據集轉換為獨立存在的多元相關性的線性組合的技術。正如預期的那樣,PCA通過確定一個單一的主成分(PC1)證實了高度的相關性,該主成分解釋了處理48小時后幾乎50%的方差(圖。5A).此外,第一主成分清楚地確定了兩個信號狀態;促進新陳代謝的藥物p38信號傳導或者p53信號傳導狀態分別由PC1的負值或正值來表征(圖。5B).接下來,我們重復PCA,但這次是在藥物治療之前收集的測量值(時間零點)。請注意,在后一種PCA實施方式中,測得活性的變化并不反映藥物反應的差異,因為還沒有應用藥物,而是孔與孔之間的微小變化,如蒸發速率或氧濃度的差異。在早期里程碑式的研究中19,20這種細胞分裂速率和細胞大小的孔與孔(或樣品與樣品)之間的差異是動物細胞中細胞大小檢查點功能的關鍵證據21。由于signalome在每個孔中提供了12種途徑的測量,它可以測試這些微小的變化是否會導致PCA可以檢測到的信號狀態的孔特異性變化。事實上,PCA還在未受干擾的細胞中顯著識別了p38和p53信號狀態(圖。5C).

圖5:五氯苯甲醚表明p38和p53信號狀態存在于預處理中,并隨時間推移而增加。
figure 5

A用122種藥物治療48小時后11個信號通路的活性得分的PCA。每種藥物的顏色表示其在圖中的簇。3A. B, C柱狀圖代表藥物治療48小時后各途徑的PC1負荷(B)或預處理(C). D當投射到由未暴露于藥物治療的細胞的測量值計算的主成分上時,途徑活性的方差。本文提供了原始數據。

為了進一步探索p38和p53信號狀態是否先于藥物治療,我們測試了對未暴露于藥物治療的細胞的測量是否可以預測藥物治療后觀察到的特定相關性(補充圖。5).這一分析確定了動態,這是穩態的典型特征(圖。5D).在藥物處理后的第一個小時,化學干擾有效地消除了未受干擾細胞中連接不同信號分支的相關活動。然而,藥物治療幾個小時后,相關的活動恢復了,事實上,變得更加突出。這些結果表明一般的應激程序:(A)在未接受藥物治療的細胞中發揮作用,(B)在藥物治療的第一個小時內被有效消除,以及(C)在藥物治療后的幾個小時內恢復活性。這個觀察結果也可以在圖2中看到。4C–H,其中兩種信號狀態在時間零點(藥物治療前)是明顯的,在一小時后消失,并在后面的時間點獲得顯著性。

p38和p53信號狀態與細胞大小的擾動有關

面對不同的化學擾動,這兩種信號狀態的恒定性表明,這些信號狀態描述的大規模相關性起著支持一些在我們的細胞系中至關重要的過程的作用。由于我們的測量是在癌細胞上進行的,我們進一步推斷,這個過程可能與連續細胞分裂的需求有關。為了維持體內平衡,增殖的細胞必須在連續的細胞分裂之間加倍它們的質量。在癌癥中,這一要求可能更為關鍵22,23,24。如果癌細胞無法滿足癌基因的增殖需求,生物合成也會相應增加,細胞大小會隨著時間的推移而減小21。因此,我們想知道觀察到的協同信號模式是否來自應激感應系統,該系統對細胞生長和細胞分裂不平衡導致的細胞大小變化做出反應(圖。6A).

圖6:細胞生長和增殖受到嚴格調控,并與p38和p53信號狀態相關。
figure 6

A一種模型,展示了細胞大小的感知如何影響細胞生長和增殖,以保持細胞大小的穩態。B散點圖顯示了雷帕霉素或SNS-032對Rpe1細胞的平均細胞生長率和分裂率的初始和長期影響。數據點表示測量的平均生長和分裂速率:(1)在藥物治療的第一個24小時期間和(2)在藥物治療的第24-60小時期間。C用生長抑制劑(紅色)或cdk1/2抑制劑(藍色)處理的五種細胞系(Rpe1、HeLa、U2OS、SAOS2、16HBE)的平均生長率對分裂率。每個細胞系中的測量值由同一細胞系的未處理對照樣品(灰色)的測量值標準化。所用的生長抑制劑為:不同劑量的環己酰亞胺、Torin-2和雷帕霉素(詳見“方法”)。所用的cdk1/2抑制劑為:SNS-032、PHA848125、Cdk2抑制劑III和地那昔布,劑量不同(詳見“方法”)。D, E給定藥物的平均細胞大小與其PC1值相關,PC1值是根據Kaufman等人的數據的報告者活性計算的(D)和劉看著艾兒。(E). F在Signalome篩選中A375細胞的平均生長率對分裂率。每個圓圈代表一個篩選條件(藥物治療)。圓圈的顏色表示該條件下PC1的值。等高線顯示PC1的平均值作為生長率和分裂率的函數。Gp38(上圖)和p53(下圖)活性的平均水平是生長率和細胞周期長度的函數。H提出影響細胞分裂的藥物如何激活p53信號狀態,而影響細胞生長的藥物如何激活p38信號狀態的模型。每個狀態反過來激活補償機制,導致新的平衡。本文提供了原始數據。

作為第一步,我們詢問選擇性干擾生物合成速率的藥物是否會觸發代償機制,從而幫助細胞在生長和增殖速率之間達到新的穩態。我們首先使用視網膜上皮細胞系RPE1,一種hTERT永生化非癌細胞系,因為它非常適合于細胞大小的研究21。為了抑制細胞分裂速率,我們使用了各種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的化學抑制劑,如SNS-03221而為了降低生物合成活性(細胞生長),我們或者用環己酰亞胺抑制蛋白質合成,或者用雷帕霉素和托林抑制mTOR活性。在所有情況下,藥物劑量都經過精心優化,以確保細胞仍在增殖,并且沒有經歷完全的細胞周期停滯。對于細胞生長(每單位時間的蛋白質合成)的定量測量,我們遵循先前描述的使用標記所有蛋白質的熒光標記琥珀酰亞胺酯(SE)的總大分子蛋白質質量的單細胞測量方案(補充方法)21,25,26.

我們的結果表明,在雷帕霉素治療的最初幾個小時,雖然細胞生長被迅速抑制,但細胞分裂率相對不受影響(圖。6B).相反,CDK2抑制劑SNS-032降低細胞分裂速率,但不影響細胞生長(圖。6B).然而,在稍后的時間點,生長和增殖的協調被重新建立,但是在稍微不同的設定點。通過促進更長時間的生物合成活性(更長的細胞周期)來適應生物合成速率受抑制的細胞。然而,這種細胞周期的延長沒有達到完美的適應,導致成對的生長和分裂值略低于比例線。類似地,為了適應CDK2抑制劑帶來的更長的生長期,細胞降低了單位時間內合成的蛋白質數量。然而,在這里,補償也是不完全的,導致成對的值位于線以上。將這些結果擴展到跨五種細胞系的多細胞周期或細胞生長抑制劑,證明生長和增殖速率的不完全補償是一種普遍現象(圖。6C).總之,我們的結果表明:(A)擾亂生物合成速率的藥物觸發分裂速率的補償性變化,反之亦然;(B)生長率和分裂率對藥物治療的適應通常是不完全的,導致生長率和分裂率的成對值位于比例線之上和之下。

為了研究我們觀察到的p38和p53信號狀態與細胞大小的穩態相關的可能性,我們詢問誘導這兩種狀態的藥物對細胞大小的影響是否不同。為此,我們根據每種化合物促進p38信號傳導狀態相對于p53信號傳導狀態的程度對其進行評分(補充方法)。然后,我們使用signalome單細胞分辨率測量來計算每種藥物對細胞分裂速率和細胞大小的影響。與我們的假設一致,我們發現促進p38狀態的藥物治療與較小的細胞大小相關,而促進p53狀態的藥物與增大的細胞大小相關(Pearson’sr= ?0.625,P= 1.68 × 10?23)(圖。6D).

為了進一步加強我們的模型,我們詢問了促進p53和p38信號狀態的藥物靶點以前是否被認為是細胞大小穩態的調節劑。在哺乳動物細胞中,Liu等人描述了對細胞大小穩態機制的全面篩選。25。在那項研究中,對NIBR MoA藥物庫查詢的細胞進行了高度定量的細胞大小測量27—一個高度特征化的化學庫,旨在探究作用機制。為了提取靶特異性細胞大小的影響,我們實施了線性回歸模型(補充方法)。這就產生了一系列基因,每一個都預測了對細胞分裂速率和細胞大小的影響。數字6E揭示了藥物靶標對細胞大小的影響之間的顯著相關性(如Liu等人,補充數據7).具體來說,劉等人描述為細胞生長抑制劑的靶點在我們的研究中被獨立地鑒定為促進p38信號狀態激活的靶點。反之,劉等人所刻畫的目標。25在我們的研究中,減慢細胞分裂的速率被獨立地確定為促進與p53信號狀態相關的信號分子激活的靶點。注意,雖然信號組數據是在A375黑素瘤細胞上產生的,但劉等人的數據。25是用HeLa宮頸癌細胞產生的。A375細胞的信號轉導測量值和HeLa細胞的細胞大小測量值之間的相關性表明,這兩種狀態與細胞大小的聯系在不同的細胞系中是常見的。

接下來,我們使用信號組來測試這兩種信號狀態是否與細胞生長和分裂速率的不平衡相關。我們發現不成比例地降低生長率的藥物(即對角線以下的數據點)與p38信號狀態相關,而不成比例地降低增殖的藥物(即對角線以上的點)誘導p53信號狀態(圖。6F,G).

p38-和p53-信號狀態與細胞生長和細胞分裂的不同關聯的額外支持來自使用字符串數據庫(http://string-db.org/)28,29,30,31。根據選擇性促進p38或p53信號狀態的藥物列表,我們詢問促進p38或p53信號狀態的藥物靶點是否在功能上不同。事實上,我們發現,雖然促進p53信號狀態激活的藥物富含細胞分裂周期的抑制劑,但促進p38狀態激活的藥物明顯富含合成代謝活性的調節劑,包括胰島素/mTORC1途徑,以及葡萄糖、糖原和碳水化合物代謝的調節劑(補充圖。6A灣).

在癌癥中,生長和分裂的不均衡變化可由細胞內遺傳變化或外部壓力(包括營養或生長因子缺乏)自發產生。為了測試p38和p53信號狀態是否存在于人類癌癥中,我們研究了TCGA(https://www.cancer.gov/tcga)從跨越32種不同類型癌癥的8167種人類腫瘤中檢索蛋白質組測量結果32,33。為了將信號組報告基因與TCGA進行比較,我們收集了8種已知與信號組中所含途徑活性相關的蛋白質或磷蛋白。使用這些蛋白質作為通路活性的替代物,我們分別分析了32種癌癥中每一種的相關信號。具體來說,對于每種癌癥,我們計算了所有與信號通路相關的成對相關系數。我們的結果表明,除了膽管癌,類似的信號分叉出現在所有其他類型的癌癥中,如補充圖所示。6F。這進一步表明了我們測量的所有信號分支上游的共同調節過程(圖。三維(three dimension的縮寫)).

作為最后一個問題,我們詢問C組中的藥物有何不同(圖。3A)使它們逃脫與p53或p38信號狀態的互斥關聯?一種可能的假設是,這類藥物通過解偶聯平衡細胞增殖和細胞生長的細胞反饋機制,靶向對維持細胞大小穩態至關重要的機制。在這種情況下,指出CDK4抑制劑是該組中得分最高的藥物之一是很有趣的。事實上,最近,我們和其他人已經證明細胞大小的穩態關鍵取決于CDK434(但不是CDK2 ),這可以解釋為什么CDK4抑制劑不堅持p38- pr p53信號狀態(補充圖。6C–E7).需要進一步的研究來更好地理解驅使其他藥物聚集c群的機制。

討論

活報告分子被廣泛用于研究細胞中的信號動力學。然而,目前,將現場報道者多路復用在一起的能力受到可被多路復用的報道者的數量以及跟蹤多路復用報道者多天而不是幾小時的能力的限制35。整合來自多個信號分支的信息對于理解復雜的生物過程至關重要。在這項研究中,我們引入了視覺條形碼,一種與特定亞細胞定位肽偶聯的熒光蛋白,它允許在實時成像應用中復用細胞。我們證明了視覺條形碼對擾動是魯棒的,具有高精度和召回率,并且適用于體外和體內的多路復用。不同亞克隆的多重化不僅增加了實驗的產量,而且降低了成本和孔與孔之間或動物與動物之間的差異36。向系統中添加更多的熒光蛋白或細胞定位可以增加其復用潛力,我們預測,如果每個細胞僅使用一個條形碼,該系統可以很容易地擴展到20-plex組合,如果每個細胞使用兩個可視條形碼,則可以擴展到200-plex以上。視覺條形碼的解卷積是使用免費軟件完成的,因此能夠在沒有許可限制的情況下使用系統??梢晽l形碼系統可用于各種各樣的應用,如體外或體內不同擾動的克隆之間的競爭分析,降低亞克隆之間切換風險的細胞實時跟蹤,以及實時報告分子的多路復用,正如我們通過Signalome細胞系所證明的。

為了生成信號組細胞系,我們為12個經過驗證的可視條形碼亞克隆添加了不同的熒光報告基因,報告癌細胞中的主要信號通路。雖然我們使用連續三輪感染(核標記、可視條形碼、熒光報告基因)產生了每個信號組亞克隆,但是我們設想可視條形碼和報告基因可以整合到單個質粒中,從而允許在具有核標記的細胞系上用混合質粒進行一輪感染,允許在幾天而不是幾周內產生額外的信號組細胞系。

而signalome技術允許在同一細胞中多路復用活報道分子(補充圖。1D),在每個細胞中加入非常少量的這種報道分子可能會對細胞產生實質性的影響。事實上,就我們所知,以前的工作是在一個細胞中結合多個活的報道分子,每個細胞最多不超過五個報道分子35,37,38,39,40。為了實現更大的多路復用,我們混合了細胞克隆,每個克隆都含有一個報告基因。雖然我們證明了12-plex signalome細胞系的使用,但我們相信通過這項技術可以容易地實現更高的多路復用。除了通過復合報道細胞系在通量上的優勢,由于所有報道分子的讀數來自相同的孔,當比較不同報道分子上的擾動效應時,預期孔與孔之間的可變性顯著降低。另一方面,不在相同細胞中存在的報道分子之間進行比較有明顯的局限性。最明顯的限制是難以區分發生在同一細胞或不同細胞中的事件。例如,如果在擾動后,報告兩條信號傳導途徑的兩個克隆的細胞子集顯示出對這些途徑中活性的抑制,則需要進行后續實驗,以發現這兩條途徑的抑制是否總是在相同細胞中或可能在不同細胞中一起產生。此外,由于我們的信號組克隆經常從單細胞擴展而來,因此驗證主要發現也適用于整個群體并且不反映細胞特異性表型是很重要的??朔@一限制的一個方法是每個信號分子報告細胞系將來自多個細胞而不是單個細胞。這種方法對視覺條形碼的召回率和準確率有什么影響還有待觀察。

為了更好地理解信號通路的相互依賴性,我們用數百種特定的化學干擾物處理了A375和PC9信號細胞株??偟膩碚f,我們的結果提出了一種解釋,即一組化學性質不同的藥物如何匯聚成數量少得多的信號狀態。生長和分裂是受多種體內平衡機制支配的基本過程。雖然不同的藥物影響不同的細胞內機制,但對生長或分裂的影響是許多不同藥物靶標的共同特征。根據該模型,藥物是否促進p38或p53信號狀態的問題不是由受影響的藥物靶標來回答的,而是由該藥物靶標如何與生長和分裂相關,即與細胞大小相關來回答的(圖。6小時).

p38與細胞大小變化的聯系與以前的報道一致25,41由此顯示p38 MAPK選擇性激活比其目標尺寸小的細胞。通過目前的研究,我們不僅證實了p38活性與細胞尺寸減小的選擇性關聯,而且進一步證明了這種小細胞尺寸依賴性信號傳導并不僅限于p38 MAPK,因為在ERK、JNK、AKT和PKA中也觀察到了這種信號傳導,它們共同構成了“p38信號傳導狀態”。此外,我們的發現還表明p53信號簇成員的大細胞大小依賴性信號傳導。在細胞大小調節的背景下,p53的這些發現可能證明是關鍵的。雖然關于細胞大小檢查點的文獻提出了在不合適的小細胞中激活的機制,但是關于在大于合適的細胞中激活的機制的文獻很少。我們關于大細胞大小依賴性p53活性的發現在癌細胞系和非癌細胞系中都得到了證實。p53與細胞大小穩態的關聯和p53與p38活性的負相關都與以前的文獻一致。在以前的研究中,已經描述了連接p38和p53的負反饋回路42,43。具體地說,這些研究表明,當p38促進p53的激活時,活性p53隨后以負反饋的方式抑制p38,從而恢復體內平衡42,43。我們關于細胞大小依賴性p53/p38二分法的發現與這些蛋白質在細胞生長中的作用有趣地一致。盡管p38的小細胞大小依賴性激活與mTORC1激活一致44,45和p38的生長促進影響,p53的大細胞大小依賴性激活與p53的mTORC1抑制和生長抑制影響一致46,47.

雖然先前的研究已經在哺乳動物細胞中建立了p38依賴性細胞大小檢查點25這些研究并沒有關注在持續增殖的群體中監測細胞大小的關鍵需求。目前的工作將增殖細胞的大小感知與生長和細胞分裂的穩態適應聯系起來。還有趣地注意到,盡管p38和p53都是公認的應激蛋白,但它們對應激條件的生理反應非常不同。激活p38的應激條件通常會促進炎癥程序,從而促進生長并抑制凋亡48。相比之下,p53的激活既是促凋亡的又是抑制mTORC1介導的生物合成的功能49.

總的來說,視覺條形碼是一個易于實施的系統,可以幫助研究人員為各種各樣的應用進行細胞多元化。該系統是高度模塊化的,可用于產生具有不同報道基因的信號體細胞系,因此可用于各種生物學領域的研究。


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