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兒童和年輕成人癌癥全基因組和轉錄組分析的可行性

 二維碼
發表時間:2022-05-25 15:17作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

癌癥全基因組和轉錄組測序(cWGTS)在腫瘤學中的效用日益得到認可。然而,由于需要在臨床相關的時間范圍內提供結果,以及對檢測靈敏度、報告和結果優先級的關注,實施cWGTS面臨挑戰。在一項前瞻性研究中,我們開發了一個工作流程,在9天內報告全面的cWGTS結果。將cWGTS與診斷組分析進行比較,證明了cWGTS在單一工作流程中以相當的靈敏度捕獲所有臨床報告突變的潛力?;鶞蕼y試確定臨床WGS測序的最佳深度至少為80倍。種系、體細胞DNA和RNA-seq數據的整合使數據驅動的變異優先化和報告成為可能,在比標準治療多54%的患者中報告了致癌發現。這些結果為在臨床腫瘤學中實施cWGTS作為一項綜合試驗確立了關鍵的技術考慮因素。

介紹

癌癥是由體細胞變異體的累積引起的,包括點突變、結構變異體(SV)和拷貝數改變(CNA ),這些變異體驅動腫瘤發生、疾病進展,并在某些情況下定義治療漏洞?;谙乱淮鷾y序(NGS)的靶向基因面板分析的引入有助于疾病診斷、指導治療,并通過完善治療方案改善了患者的預后1,2,3,4,5。然而,目標小組被優化以評估常見癌癥的臨床生物標志物1,2,4。最近的研究顯示了全外顯子組測序(WES)在鑒定罕見癌癥基因編碼突變中的效用6,7。然而,對于具有低突變負荷、獨特的甲基化譜8,9主要由SVs和融合基因驅動,在大多數情況下,panel/WES測試不能識別臨床生物標志物1,2,3,4,7。這強調了對更好的診斷工作流程以指導臨床管理的未滿足的需求。

癌癥全基因組和轉錄組測序(cWGTS)提供了評估種系和體細胞獲得性突變、SV和CNA的全光譜,以及腫瘤突變負荷(TMB)和全基因組突變模式的量化的機會10。最近的文獻越來越多地證明了cWGTS在兒科和罕見癌癥中的可能臨床效用7,11,12,13,14,15,16。然而,WGS在腫瘤學中的臨床實施受到以下因素的挑戰:測序成本、實驗室的復雜性、在臨床相關時間框架內處理大規模數據的分析工作流程、對低覆蓋率WGS在檢測高深度面板分析捕獲的可操作突變方面的敏感性的擔憂,以及cWGTS研究結果在臨床實用性方面的可解釋性3。在這里,我們證明了在患有罕見癌癥的兒童、青少年和年輕成人實體瘤患者的初級癌癥護理中實施cWGTS的可行性、分析有效性,并解決了關鍵的技術問題。

結果

試樣處理

該研究隊列包括初診或復發/難治性疾病的患者。在201例被提名進行配對癌癥/正常全基因組和轉錄組測序(cWGTS)的新鮮冷凍(FF)腫瘤患者中,58例在病理審查時被排除,29例不符合WGS評估的腫瘤純度> 20%的要求。大多數被排除的病例是治療后的神經母細胞瘤和肉瘤樣本,以壞死性疾病為主。最終隊列包括來自114名患有實體瘤的兒童、青少年和年輕成人患者(中位年齡= 12.6歲,范圍:4.5個月至43.8歲)的單個樣本(補充表格1, 2,補充圖。1a–d).

用于臨床決策支持的cWGTS工作流的實現

為了構建臨床cWGTS工作流程的原型,我們開發了一個端到端流程(圖。1a)其中包括專用的:1。項目管理團隊,2。樣品處理的實驗室操作員,3。cWGTS的定序機,4。數據導入頻道,5。生物科學平臺,用于分析管道的自動部署以及與機構和公共數據庫的API集成17, 6.高性能計算環境中的保留計算節點?;蚪M發現的優先排序和報告的系統管道(圖。1a,補充圖。1e).我們量化了從樣本采集到生成自動化報告的端到端時間。從手術活檢提交時開始審核時間日志,以報告交付跨學科分子腫瘤委員會審查我們研究中的樣本,并通過我們的生物科學平臺記錄審核跟蹤(補充圖。1e).端到端,在開發階段,該工作流平均在17天內執行(范圍:11–29,n= 59個樣本),達到完全優化的工作流程,最終周轉時間為9天(圖。1b, n= 16).這比許多臨床NGS面板測序測試的標準周轉時間(TAT)短(2-4周)1,2,4明顯快于文獻中大多數WGS處理時間(3-8周,圖。1b)11,12,13,14,15,16并且可與由諸如Hartwig基金會的大規模中央基礎設施實現的TAT相比18。這證明了在綜合癌癥護理中心實施cWGTS分析以支持具有臨床相關周轉時間的診斷和治療決策的可行性。

圖1:端到端的cWGTS工作流。
figure 1

a端到端cWGTS工作流程的示意圖,包含每個步驟的中值持續時間(小時)信息,由四個連續批次的計時試驗確定,包括n= 16個腫瘤和執行工作流程所需的專用資源的表示。b文獻中最佳報告周轉時間的比較,從樣本采集到結果準備供腫瘤委員會審查。在我們的研究中,我們顯示了一個橙色條,表示n= 16個樣本,最小和最大時間用誤差線表示。這些樣品經過優化后處理。

利用cWGTS進行全面的基因組表征

在所有突變類別中,cWGTS平均每個樣本識別出7353個獲得性突變,其中99%為癌癥相關變異(n= 114)的患者(補充圖。2).這些包括CNA(n= 105名患者)、種系素質(n= 17)、癌癥相關基因的突變(n= 77)、易位/融合轉錄物(n= 27)、疾病相關的SVs(n= 75),以及異常TMB或微衛星不穩定性(MSI)分數(n= 7)(補充表)3).其他感興趣的信號包括突變標記的描繪19色絲菌的檢測20或者全基因組復制(WGD)21癌癥相關病毒序列(即EBV)22,23端粒長度的估計24和基因表達特征。SVs,其中大部分只能用WGS檢測,代表了第三種最常見的基因組改變。

cWGTS與靶向DNA和RNA檢測的一致性分析

在我們的隊列中,MSK IMPACT對相應的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)活檢標本進行了靶向DNA分析4根據OncoKb級的定義,檢測到可操作的生物標志物2524%的患者(n= 27)(圖。2a–c,補充表4).與先前的研究結果一致,即通過小組測序證明患有罕見癌癥的患者不會產生臨床相關的生物標志物4,我們隊列中的大多數患者(76%,n= 87)沒有治療信息改變。這些結果代表了MSK擴大的兒科/年輕成人患者群體(補充圖。3a,b).

圖cWGTS對臨床生物標志物的分析有效性。
figure 2

a左側柱狀圖描述了根據OncoKb定義的MSK-IMPACT(1-4級)報告的治療知情、致癌或無相關發現的患者比例。右邊的柱狀圖顯示了研究群組中最高水平的OncoKb注釋的分解(0,1,2)。b柱狀圖展示了研究隊列中信息性生物標志物數量對最高OncoKb水平的分解。c顯示最高OncoKb水平按疾病類別細分的柱狀圖。d散點圖顯示了MSK-IMPACT (x軸)報告的MSK-IMPACT變異體的變異等位基因頻率(VAF)與WGS數據堆積(y軸)(皮爾遜相關)的絕對VAF估計值的比較。沿著x軸觀察到差異突變。突變通過調用狀態進行顏色編碼,其中兩者在兩種測定中都被調用,ITH是在更高深度的重新測序和/或had比例測試中未被調用的突變p-值< 0.05。e柱狀圖展示了MSK-IMPACT突變的分解,在WGS和MSK-IMPACT或僅在MSK-IMPACT (ITH)觀察到。f對cWGTS中MSK撞擊/MSK融合報道的致癌融合的驗證。星號表示SS18-SSX1據MSK報道,核聚變被報道為SS18-SSX2通過RNA-seq并由WGS的跨越閱讀支持。每個患者下面列出的主要腫瘤疾病代碼(ARMS腺泡狀橫紋肌肉瘤、CHS軟骨肉瘤、DLGT彌漫性軟腦膜膠質神經瘤、DSRCT促結締組織增生性小圓細胞瘤、ES Ewing肉瘤、MBL髓母細胞瘤、MFH未分化多形性肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤/高級梭形細胞肉瘤、RCSNOS圓細胞肉瘤、NOS、SYNS滑膜肉瘤、us未分化肉瘤、USPC腹腔未分化肉瘤)。補充數據中提供了面板a-e和f的源數據46.

我們首先評估了MSK-IMPACT捕獲的突變是否也被WGS檢測到。對于所有不一致的樣品,我們對用于產生WGS文庫的相同DNA等分試樣進行了MSK影響。這使我們能夠確定差異呼叫是由于檢測靈敏度的差異(MSK-IMPACT和WGS)還是腫瘤內異質性的結果(ITH)26.

MSK-IMPACT報告的221例體細胞突變中,174例(79%)發生在WGS(圖。2d,e).這包括MSK-IMPACT報告的68/83 (82%)的致癌突變25(補充圖3c).兩種檢測法所稱的變異體的變異等位基因頻率(VAF)在5%到97%之間,具有高度一致性(r2= 0.75)在VAF估計(圖。2d).大多數不一致突變(46/47)在MSK影響中是亞克隆的(< 90%的癌細胞部分),15個被歸類為致癌的(補充表4,補充圖。3c).不一致突變表現為大范圍的VAF(范圍:2.2-39%,中位數= 8.5%)(圖。2d)并且在有效覆蓋率方面沒有顯示出系統性偏差(補充圖。三維(three dimension的縮寫)).47個不一致突變局限于26個樣本(每個患者1-7個突變)。MSK-IMPACT對WGS文庫的44個不一致變異體進行了定向重測序,盡管測序的局部深度中值為469倍,但沒有一個變異體被測序,支持ITH是差異的基礎(補充圖。3e).進一步證實ITH、WGS和相同FF DNA等分試樣的靶向重測序數據確定了10個突變(VAF:6-31%),MSK-IMPACT從患者匹配的FFPE樣本中沒有報告這些突變。10個額外呼叫中的3個是癌癥相關變異體(TP53 L265Yfs*81、PPM1D S468*和HLA-A L102Hfs*73)(補充圖。3e).

這些驗證研究表明,不一致的呼聲是由于隨機抽樣的異質性腫瘤26(補充表格4)和WGS和MSK-IMPACT之間的一致性為至少94% (43/47總不一致),當在兩種測定中使用相同的DNA等份時,對于可評估樣品中的所有43個突變,一致性高達100%。

MSK種系評估-影響27在13名患者中鑒定出易感性變異,并使用MSK融合技術進行小組RNA評估2818(補充表)中已鑒定的致癌融合基因5, 6,圖。2f).cWGTS捕獲了所有13個種系素質變異體和18個融合體。重要的是,WGS和RNA-seq中的數據都支持融合基因,這提供了在單個工作流程中正交驗證發現的機會(圖。2f).這些發現表明,cWGTS作為一種綜合檢測方法,可以檢測一系列標準護理診斷試驗捕獲的種系、體細胞突變和融合基因。

技術考慮:臨床測序的最佳覆蓋深度

體細胞變異檢測的靈敏度直接取決于活檢的腫瘤細胞性和測序覆蓋的深度。cwg的中值深度為95倍(范圍為67–181 ),腫瘤純度范圍為21%至100%,導致中值有效覆蓋率為64×(中值深度*純度估計值)。為了評估最佳測序深度,對于WGS覆蓋率≥60倍的97個腫瘤,我們生成了298個衍生二次抽樣BAM文件,范圍為100倍、80倍、60倍和30–40倍(補充圖。4a,補充表7).MSK-IMPACT和WGS(n= 220)、跨變體類別的全基因組突變和TMB(圖。3a,補充圖。4b,c).檢測靈敏度與有效覆蓋率相關,并受變異類別的影響,對SVs的靈敏度略低(圖。3a).在致癌發現中,91%以上在30-40倍時被捕獲,98%以上在60-100倍時被召回(圖。3a).測序覆蓋率較低時,檢測亞克隆的能力有限(VAF范圍:4.3-31%,中位數= 9.5%)(圖。3b,c).跨變異類別的全基因組突變檢測的最佳靈敏度在≥80倍時達到,并隨著覆蓋率的增加而增加。數字3c通過測序覆蓋深度、腫瘤純度和變異克隆代表提供變異檢測靈敏度的概述。

圖3:對WGS最佳覆蓋范圍的評估。
figure 3

a柱狀圖展示了變異體檢測的靈敏度和95%置信區間(誤差線),覆蓋深度從左至右為:1。MSK-IMPACT和WGS檢測到的臨床相關事件(n= 220), 2.全基因組SNVs,3。全基因組索引,和4。全基因組SVs。僅來自原始中值覆蓋率> 100倍的樣本的數據(n= 32)。紅點表示在相同二次抽樣水平下所有bam中所有突變的總體敏感性。b研究隊列(H135973)中代表性樣本的每個二次抽樣水平的變異等位基因頻率直方圖,顯示在較低的測序覆蓋深度下檢測亞克隆突變的靈敏度下降。cMSK臨床相關呼叫的二次抽樣BAMs中有效局部覆蓋與VAF的散點圖-IMPACT。二次抽樣bam中調用的變量用圓圈表示,而遺漏的變量用X表示。趨勢線顯示了獲得至少2個變異讀數的累積二項式分布,給出了有效覆蓋率和變異等位基因分數。面板的源數據a, c在數據倉庫中提供。面板的原始數據b可在dbGAP研究中獲得。

僅由cWGTS檢測到的生物學和臨床相關性研究結果

未通過臨床小組測序確定的cWGTS結果的臨床相關性(MSK影響4,MSK-聚變28和88種癌癥易感基因的小組測試27)由多學科分子腫瘤委員會確定。與最近的研究一致7,11,12,13,14,15,16,cWGTS分析在54%的患者中發現了至少一種額外的癌癥相關致癌變異(n= 62).其中,33名患者有一個或多個與臨床直接相關的發現,包括7個診斷性(21%),15個預后性(45%),5個治療告知性(15%),5個以前未描述的腫瘤融合(15%)和6個生殖系(18%)生物標志物(圖。4a,補充表3).大多數額外的相關發現可以通過SVs和融合的檢測以及全基因組突變信號來解釋(圖。4b).

圖4:與護理標準相比,cWGTS檢測到的其他相關結果。
figure 4

acWGTS的其他相關發現的熱圖,用何種技術(WES、WGS和RNA-seq)可以檢測每個事件來著色。列代表患者,而行是臨床事件類型。種系的星號表示突變特征支持的致病性。b(上圖)具有臨床相關檢測結果的患者的堆積條形圖細分。藍色區域(實線或網格)代表具有靶向測序(RNA和DNA)相關發現的患者,而橙色區域(實線或網格)代表具有cWGTS發現的患者。藍色/橙色網格表示在靶向測序和WGTS中均有相關發現的患者。(底部)從上往下橙色部分(實心或網狀)中患者的cWGTS特定發現的堆積條形圖細分。相關調查結果按事件類型進行著色。SV,結構變體。TMB,腫瘤突變負擔。微衛星不穩定性。小Mut,小突變,包括取代和插入/缺失。病毒,病毒整合。面板的源數據a, b在補充數據中提供3.

我們進一步推斷,通過對基因編碼區的掩蔽結果,WES將捕獲額外發現的部分。在62名cWGTS發現增加的患者中,單獨的RNA-seq和WES僅在10名(16%)和8名(n= 13%)的患者,或者當合并時有17名患者(圖。4a,補充表3).因此,在cWGTS中只有27%的發現可以被WES和RNA-seq捕獲,因為大部分額外的發現歸因于SVs。

已確定的癌癥基因中的罕見變異

我們確定了針對已知罕見癌癥基因的七項臨床相關發現(補充表格5, 8).其中,三個是體細胞獲得的,包括一個疾病定義突變KBTBD4(p.R313_M314insPRR)在中等分化的松果體實質腫瘤中的表達29,30,一個SETBP1生殖細胞腫瘤中的(p.D868N)突變SIX1腎母細胞瘤中的突變(p.Q177R)31。此外,在四個癌癥相關基因中檢測到了臨床相關的種系變異,包括最近推出的智能電池數據集橫紋肌肉瘤中的剪接位點突變(c.258 + 2T > C ),BARD1頁(page的縮寫)神經母細胞瘤中的E652fs*69,EP300頁(page的縮寫)兩例骨肉瘤患者的A2259fs*20和EXT2 p.W414*(補充表5).這些結果證明了cWGTS在捕獲罕見癌癥基因的體細胞和種系變異中的效用,這些基因在靶向組中不進行常規評估2,4.

融合基因

在先前臨床試驗沒有發現的患者中,從WGS和RNA-seq中鑒定出8個符合讀框的融合基因(補充圖。5,補充表6),其中5個之前沒有描述過。對于診斷相關性,我們確定:1。一個t(2;6) (PAX3-FOXO31)在被診斷患有胚胎性橫紋肌肉瘤(ERMS)的患者中,在沒有主橫紋肌肉瘤融合的情況下,對腺泡狀橫紋肌肉瘤(ARMS)的易位改變診斷(PAX3-FOXO1PAX7-FOXO1)32(圖。5a、b), 2.aUACA-LTK轉移性甲狀腺乳頭狀癌的融合33,和3。哀婉的SH3PXD2A-HTRA1融合建立一個神經鞘瘤患者的診斷評估復發的第四階段神經母細胞瘤34.

圖5:用于變體注釋的DNA和RNA發現的整合。
figure 5

a上圖顯示了y軸上的絕對拷貝數和導致以下結果的結構變體(SV)PAX3-FOXO3患者H134768出現融合。下圖顯示了由相應基因組SV產生的RNA融合產物。b橫紋肌肉瘤樣本甲基化數據的tSNE聚類按疾病亞型進行顏色編碼(ARMS:肺泡型,ERMS:胚胎型,SCRMS:梭形細胞,SRMS:硬化型)。病人藏著PAX3-FOXO3融合星團與ARMS樣本。c上圖顯示了6號、9號和18號染色體中的染色體倍性事件,導致了獨立企業聯盟增強劑因同源物患者H133676的基因位點。下圖顯示了來自Drier等人,Nature Genetics 2016的H3K27me3染色質標記。d箱線圖顯示了因同源物事件(H133676)以橙色突出顯示,表明面板中的SV事件c與MYB的過度表達有關,證實SV是一個增強子劫持事件。eSV事件定位圖TP53骨肉瘤患者的基因體(n= 12,第13個患者的事件斷點落在基因體之外)。SV顯示為箭頭,y軸上的絕對拷貝數(灰點)覆蓋了的外顯子結構TP53(TRA:易位,DUP:復制,DEL:缺失,INV:倒位)。f箱線圖顯示了以下各項的對比TP53之間的RNA表達TP53-重新排列的樣品和沒有任何重新排列的樣品,其中心線表示中位數,晶須延伸在+/-1.5倍IQR范圍內(雙側Mann-Whitney U檢驗,p= 1.645e-03)。面板的原始數據ac可在dbGAP研究中獲得。面板的源數據e在補充數據中提供9。面板的源數據d, f在數據倉庫中提供。

潛在的治療相關性,我們確定了一個NTRK3-SLMAP神經母細胞瘤患者的融合。使活動NTRK3融合蛋白是TRK抑制劑有希望的治療靶點,在兒童和成人癌癥中都有活性35。然而,篩查資源工具包融合并不是所有疾病適應癥的常規操作。其他未描述的融合包括EPC2-AFF3MAN1A2-ACBD6在兩例未分化肉瘤患者中發現CITED2-馬達加斯加阿里亞里未特指的圓形細胞肉瘤的融合。

靶向腫瘤抑制基因的結構變體

已確定預后相關性的結構變異36在我們的隊列中觀察到,提供了臨床相關性的見解。cWGTS映射事件在端粒酶催化亞基綜合征神經母細胞瘤患者分別為8例(28%)和5例(17%)。兩者端粒酶催化亞基綜合征越來越被認為是神經母細胞瘤的治療風險分層生物標志物37。這端粒酶催化亞基SV只能由cWGTS識別,并且只能由綜合征MSK-IMPACT報告了刪除情況4.

我們還觀察到復發的SVs靶向腫瘤抑制基因DLG2在15/29的OS患者中38和3/29成神經細胞瘤,其中6個有純合缺失(補充表9).正在…DLG2骨肉瘤的特征是38我們的發現表明DLG2SVs在神經母細胞瘤中也是復發的,值得在未來的研究中進一步研究。

整合RNA-seq和WGS用于變體注釋

對基因組非編碼區復雜SVs的解釋對WGS發現的報道提出了一個主要挑戰。cWGTS使得SVs的伴隨檢測和受影響位點的轉錄結果的評估成為可能。例如,一個染色體倍性事件導致因同源物致癌基因39通過“劫持”一架獨立企業聯盟增強劑(圖。5c,d)在一個腺樣囊性癌中被檢測到,但沒有信息性的臨床測序結果。正在…因同源物過度表達是腺樣囊性癌的主要特征,因同源物使用常規診斷分析,僅在30%的病例中識別出融合39?;虮磉_數據的整合對于注釋和報告這種復雜的非編碼SV作為疾病定義診斷生物標志物是至關重要的。

同樣,在29例骨肉瘤患者中,我們發現TP5312個突變和定位的非編碼SVsTP53地點在13號。其中,只有3起是MSK-IMPACT報告的(圖二)。5e).與RNA-seq的整合證明TP53SVs與下列指標的喪失相關TP53表達,驗證它們的功能相關性(圖。5f).野生型TP53代表p53途徑調節藥物試驗的納入標準40。在這里,我們表明,在沒有cWGTS的情況下,患者失去TP53SVs已在多種癌癥中被描述,可能被錯誤地診斷為TP53野生型對治療方案評估的影響40。我們沒有鑒定出針對腫瘤的種系SVTP53軌跡。

綜上所述,我們的發現說明了在變異檢測、注釋和臨床cWGTS報告的優先排序中結合RNA和DNA分析的必要性。在我們的自動化工作流程中,我們通過詢問DNA突變來尋找RNA中的確鑿證據。通過WGS和RNA-seq兩者正交地檢測到所有由RNA-seq組分析報告的復發融合基因以及8個額外的驅動融合基因(補充圖。5).此外,基因表達數據與SV發現的整合解決了SV靶向基因組上非編碼區的功能后果(例如,因同源物增強器劫持和TP53失活)。

全局基因表達特征進一步用于根據腫瘤類型對樣本進行聚類,為解決患者的診斷提供了進一步的機會(補充圖。6a).最后,在101名有RNA-seq數據的患者中,我們平均每個樣本鑒定出18個基因表達生物標志物(范圍= 1-99)16(補充表格10).然而,關于這種表達生物標志物的臨床應用的證據仍有待驗證。為此,我們對具有已知組織特異性表達模式的異常表達基因和從cWGTS中檢測到的SVs或融合體進行了系統的詢問??偟膩碚f,只有8%的表達生物標記物與獲得性SV或融合基因相關,劃分了高可信度表達生物標記物的子集(平均每個患者= 1,范圍= 0-10)。這將我們隊列中具有SV支持的表達生物標志物的患者數量限制在54%(n= 55)(補充圖。6b).為了證明這種綜合分析的效用,我們發現了一個伴隨現象喀斯特地貌通過臨床試驗,在兩名無臨床相關生物標志物(H135462和H195916)的患者中擴增和過度表達。值得注意的是,在兩位患者中,MSK-IMPACT沒有報告擴增,這表明基于檢測組的分析檢測拷貝數變化的靈敏度較低。

種系突變與體細胞突變標記的整合用于變體注釋

種系變異的注釋僅限于人口數據庫中的重復事件,因此限制了對罕見創始者事件的解釋。對于我們隊列中的每個基因組,我們量化了歸因于73個參考突變信號中每一個的突變比例10。三分之二具有DNA修復基因種系突變的患者進一步具有提示DNA修復缺陷的突變特征?;颊逪135421在MUTYH和第二等位基因的體細胞缺失。大約42%的突變歸因于MUTYH簽名SBS3610(圖。6a).患者H135466在PMS2(c.538-1G > C)通過LOH丟失野生型等位基因。該腫瘤MSI高,伴有高突變(TMB = 11.23,indels = 90,246,SNVs = 17,840,SVs = 44),T > C突變富集,重復介導的indels特征為PMS2缺乏10(圖。6b).相比之下,患者H135073在2005年攜帶了一個未知意義的變異體(VUS)PMS2中等MSI得分(7.23),低突變負荷(1.30 Muts/Mb),沒有證據表明PMS2簽名(圖6c).這些發現證明了突變信號在評估DNA修復基因種系突變中的效用。

圖6:四個不同患者的體細胞突變的全基因組分布和模式。
figure 6

a攜帶致病種系的神經母細胞瘤患者(H135421)MUTYH變體(c.924 + 3A > C)。b具有致病種系的未成熟畸胎瘤患者(H135466)PMS2突變(c.538-1G > C)。c具有種系的惡性外周神經鞘瘤患者(H135073)PMS2意義不明的變體(VUS)(第W841頁*)。對于每個患者,頂部面板是Circos圖,顯示了基因組中不同類型的體細胞突變。最外面的環顯示了由突變堿基的嘧啶配偶體顏色編碼的所有snv的相互突變距離。中間的環顯示小的插入(綠色)和刪除(紅色)。最里面的環顯示拷貝數的變化,弧線顯示SV。中間的圖是柱狀圖,顯示了歸因于腫瘤中最高暴露的五個突變信號的突變的絕對數量。下圖是顯示SNVs的96個三核苷酸背景的柱狀圖。d復發性骨肉瘤患者隊列外發現的體細胞突變的全基因組分布和模式(H201472)。WGS結果顯示樣本是高度突變的,富含SBS26、T > C突變、重復介導的缺失和MSI不穩定。這個病人被發現攜帶一種病原體PMS2變體(p.D699H)(重復缺失:重復介導的缺失,m-同源性:微同源性介導的缺失,缺失其它:所有其它缺失,TRA易位,DUP復制,DEL缺失,INV倒位)。這一數字的原始數據可以在dbGAP研究中獲得。

為了說明這一點,在研究隊列之外的一名12歲骨肉瘤患者中,cWGTS描述了一個高突變的基因組(TMB = 16.7,indel = 89,588,SNVs = 31,520,SVs = 568),富含重復介導的缺失,與MSI高狀態一致(圖。6d).這一觀察促使人們同意進行種系測試,結果發現PMS2突變(p.D699H)被注釋為可能致病/VUS41以及野生型等位基因的體細胞缺失。MSK-IMPACT報告了不確定的MSI狀態(7.5),但經檢測證實種系突變是致病的。

這些結果證明了整合來自cWGTS(種系突變、等位基因特異性拷貝數和全基因組TMB)的綜合讀數的效用,從而為評估和報告種系易感性突變提供確證證據,并對家族篩查、診斷和治療產生影響。

新出現的生物學和臨床相關性的基因組改變

最近的研究提出端粒長度作為其他癌癥中神經母細胞瘤的預后指標42,43,44,45。我們概述了已建立的聯系綜合征端粒酶催化亞基端粒長度的突變46,47(補充圖7a–c). 綜合征在8例骨肉瘤中也觀察到突變,與端粒長度相似(補充圖。7c).考慮到不良風險突變和端粒長度之間的關聯,獨立預后值的描述保證了對數據的分析,這些數據同時描繪了這些突變、SVs和端粒長度以及已建立的預后預測因子。

我們檢測到色絲菌20在40%的患者中,最常見于肉瘤(35/58)、生殖細胞瘤(2/4),較少見于神經母細胞瘤(6/29)(補充圖)。7d).色絲菌經常導致TP53損失(10月29日)20,48,放大真菌學, 血管內皮生長因子,以及MDM2。此外,在2名患者中,色絲菌導致致癌融合(MAN1A2-ACBD6PAX3-FOXO3)(補充圖。7e).先前的研究提出了全基因組重復(WGD)和癌癥預后不良之間的聯系21。在肉瘤(24/54)、癌(3/7)和成神經細胞瘤(11/30)中富集的42/114患者中觀察到WGD(補充圖)。7f).

不同類別腫瘤突變負荷的生物學和臨床意義

基于小組的方法得出TMB、MSI評分和突變特征的估計值49,而WGS直接量化所有變異類別的全基因組突變負擔(圖。7a,b和補充圖。8a).我們在我們的隊列中觀察到,相對于兒科癌癥的報告,總體TMB估計值更高(8.3倍)(圖。7a)10,48,50。接受治療的患者樣本的TMB高于未接受治療的患者樣本(接受治療的患者樣本為0.1–11.2,未接受治療的患者樣本為0–2.7,Mann–Whitney檢驗,p= 1.892e-04),并與治療相關特征(即替莫唑胺、鉑)的證據相關(補充圖。8b)10,51,在45/114名患者中觀察到,表明暴露于癌癥治療并存活的克隆持續存在52.

圖7:免疫治療背景下的全基因組突變負荷。
figure 7

aWGS評估的編碼腫瘤突變負荷(TMB)在整個隊列中的分布(n= 114),根據取樣時患者的治療狀態進行著色。虛線表示中位數編碼TMB (SNVs和indels ),如先前零兒童癌癥研究報道的?;颊甙醇膊☆悇e分組(NB:成神經細胞瘤,CNS:中樞神經系統,C:癌,WT:腎母細胞瘤,Germ:生殖細胞瘤,H:肝母細胞瘤,O:其他)。對免疫療法有反應的癌癥患者C1和C2被標記。b結構變體(SV)(右)和基因融合(左)負荷在WGS和RNA-seq均可用的樣品中的分布(n= 101).患者C2具有低質量的RNA樣品,因此顯示了來自同一患者的另一時間點的克隆融合。c(上圖)腫瘤C1 (H135022)患者的全基因組分布和體細胞突變模式,該患者患有轉移性腎上腺皮質癌,表現為高SV負荷。Circos圖如圖所示。6。PET成像顯示用nivolumab和ipilimumab治療后,大的肺轉移病灶(紅色箭頭)消失。dH135462的全基因組分布和體細胞突變模式,這是一名14歲的復發性難治性低分化透明細胞癌患者,具有高TMB和SV負荷。Circos圖如圖所示。5。PET成像顯示,在接受培溴利珠單抗治療后,多發性轉移病灶(紅色箭頭)消失。面板a和b的源數據在數據儲存處提供。面板的原始數據c, d可在dbGAP研究中獲得。

患者H135022(腎上腺皮質癌)和H135462(透明細胞癌)患有進行性治療轉移疾病,在缺乏通過臨床試驗告知治療的生物標志物的情況下,處于其治療方案的末期。cWGTS分析揭示了一個深度重排的基因組,這兩位患者在隊列中融合負荷和SV負荷最高(圖。7b–d).H135022接受了檢查點阻斷治療(nivolumab/ipilimumab ),在三個治療周期后產生了完全緩解,并且在治療停止后26個月無病(圖。7c),而患者H135462接受了彭布羅利珠單抗治療,在6個周期后達到完全緩解,并在治療后10個月保持無病狀態(圖。7d).

這些發現證明了cWGTS在全面評估不同類別的基因組不穩定性水平方面的價值,并強調了進一步評估SV和融合基因負荷作為免疫檢查點阻斷治療反應的生物標志物的必要性。

無細胞DNA中綜合WGS譜的推導

我們的研究評估了FF活檢中cWGTS作為腫瘤DNA最佳來源的關鍵技術考慮。然而,有限的活檢可能會限制所有患者獲得cWGTS。來自血漿的無細胞DNA (cfDNA)代表了用于腫瘤概況分析的DNA的替代來源53。最近,包括WGS在內的cfDNA NGS譜已被用于檢測兒科腫瘤中腫瘤特異性CNAs和片段模式54,55,56。然而,高深度WGS在從cfDNA鑒定患者癌癥基因組的遺傳變化(SNVs、indels和SVs)的組織幼稚型鑒定中的潛力在很大程度上還未被探索。

在探索性分析中,我們對匹配的FF樣本和腫瘤活檢時收集的7名患者的cfDNA進行了WGS(補充表11).cfDNA全基因組覆蓋范圍從94到102倍不等(圖。8acfDNA中的腫瘤含量范圍很廣,約為10–83%(圖。8b).為了評估cfDNA在無偏全基因組突變檢測中的適用性,我們對所有變異類型(SNVs、indels、SVs和CNA)的cfDNA進行了從頭突變檢測,并將結果與FF分析進行了比較。

圖8:來自匹配的新鮮冷凍腫瘤組織和cfDNA的WGS數據的比較。
figure 8

acfDNA中按估計腫瘤背景排序的覆蓋值。b腫瘤含量的估計。c柱狀圖顯示了cfDNA中存在于匹配的新鮮冷凍腫瘤中的從頭突變調用的比例,按變異類型細分。不含高可信度SV的cfDNA樣本用星號表示。dH158182匹配的新鮮冷凍(左)和cfDNA(右)樣本的全基因組分布和突變模式。Circos圖如圖所示。6. eH158182的個體水平克隆性分析。(左)所有替換的癌細胞比例(CCF)值的散點圖,由估計的聚類進行顏色編碼。(中間)標注了臨床相關變異的聚類的系統發育樹表示。(右)克隆水平突變特征分析,顯示歸因于每個突變特征的突變比例,每個聚類中的突變總數顯示在右側。盡管不能確定與這些克隆相關的驅動因子,但cfDNA特異性SNV調用概括了FF樣本中的突變特征,并且富含鉑相關的突變特征,表明循環中存在暴露于治療的腫瘤亞克隆。(重復缺失:重復介導的缺失,m-同源性:微同源性介導的缺失,缺失其他:所有其他缺失,TRA:易位,DUP:重復,DEL:缺失,INV:倒位)。面板的源數據a, b在補充數據中提供11。面板的源數據c在數據倉庫中提供。面板的原始數據d, e可在dbGAP研究中獲得。

cfDNA的WGS在數據生成或跨突變類別的假陽性變異調用方面沒有表現出技術限制。高質量變異細胞的產生取決于循環腫瘤DNA (ctDNA)的數量。在4名ctDNA含量足以進行CNA檢測的患者中,我們在FF和cfDNA CNA譜之間建立了良好的一致性(圖。8c,補充圖。9a–g).引人注目的是,對于具有高ctDNA含量(即IH158182)的患者,我們獲得了全基因組突變模式的接近完整的圖片,證明癌癥基因組景觀可以通過cfDNA WGS完全再現(圖。8d).重要的是,對于患者H135967,我們證明即使估計ctDNA含量為20%,與FF材料分析使用的閾值相同,我們也可以檢測FF樣本中所有已知的致癌事件,包括變異類型TP53替換,真菌學CCNE1擴增和靶向ARID1A和ATRX的SVs(補充圖。9c).

與實體活檢相比,我們進一步證明了cfDNA在捕獲腫瘤系統發育中不同類型變異的綜合表現方面的潛力(補充表11)通過檢測cfDNA特異性亞克隆(圖。8e,補充圖。9a–g).這些結果為從液體活檢獲得腫瘤不可知的綜合WGS譜的可行性提供了概念證明。

討論

我們對腫瘤學臨床護理實踐中的cWGTS實施進行了全面的技術評估。我們證明,使用單一的集成工作流程,cWGTS可以捕獲使用多種標準護理診斷分析進行評估的癌癥相關基因組變化的全光譜。隨著最佳實驗室和計算實踐的實施,我們在9天內完成了端到端的樣本到報告的周轉時間,這符合診斷和護理決策的臨床需求,并可與大規?;A設施相媲美18。盡管測序覆蓋率比基于小組的分析低5-10倍,但我們證明,在匹配的活檢中,cWGTS通過高深度靶向分析恢復了所有臨床報告的變異。我們建立了> 80倍的覆蓋率和至少20%的腫瘤純度來達到這種靈敏度。然而,這為新鮮冷凍腫瘤標本設置了嚴格的質量門檻,這些標本不像FFPE那樣容易獲得。然而,WGS在FFPE的一個主要限制是全基因組調用的高錯誤率57。為此,我們提供了概念驗證的可行性數據,證明在診斷或復發時循環中cfDNA含量高的患者中也可以利用全面的WGS分析。我們的發現為未來的研究鋪平了道路,這些研究集中于從cfDNA中分析驗證和優化全面的腫瘤不可知WGS譜用于診斷目的。

為了支持cWGTS變體注釋和優先排序,我們實施了一個分析工作流,該工作流從變體注釋數據庫中學習,并整合了來自種系突變、體細胞DNA和RNA-seq發現的信號。這允許我們注釋、驗證和優先化診斷的SV(例如,因同源物增強子劫持)、預后(例如,綜合征/端粒酶催化亞基),以及治療相關性(例如,TP53功能喪失SVs)。與兒科和罕見癌癥的近期文獻一致7,15,16,58,> 50%的患者有其他已確定的生物學或臨床意義的發現。這些發現中的大部分是癌癥基因、融合基因和全基因組突變信號中的SV,靶向小組沒有優化設計來識別這些SV。重要的是,我們證明了WES和RNAseq單獨或聯合使用只能捕獲這些額外發現中的一小部分。需要進行更大規模的隊列研究,以確定cWGTS捕獲的臨床相關生物標志物的發生率和流行率。

cWGTS的臨床相關性超出了罕見癌癥的范圍59。我們發現,通過cWGTS,我們可以在99%的患者中檢測到全系列的癌癥相關突變?;颊叨ㄖ漆t療的愿景保證了臨床決策的交付,這些決策超出了單個可用藥生物標志物的范圍,而是考慮了來自患者癌癥基因組的復合讀數,這些讀數告知了患者發展癌癥的先驗風險、診斷、治療反應的可能性、進展風險和治療弱點。隨著越來越多地在注釋良好的臨床樣本上實施cWGTS15,16,58,我們解釋cWGTS結果的能力將會提高,并且通過擴展,cWGTS的臨床效用將會擴大。隨著cWGTS的經濟障礙及時得到緩解,癌癥基因組的單一綜合評估將取代前瞻性臨床測序中的多重靶向診斷試驗59.


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