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實體瘤細胞谷氨酰胺缺乏導致對核糖體RNA合成抑制劑的抗性

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發表時間:2022-07-01 14:33作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

核糖體生物發生是一個能量昂貴的計劃,由營養的可用性決定。在這里,我們報道營養剝奪嚴重損害前體核糖體RNA(前rRNA)的加工,并導致未加工rRNA的積累。營養恢復后,饑餓狀態下儲存的前rrna被加工成成熟rrna,用于核糖體生物發生。營養脅迫下未能積累前rRNAs導致營養恢復時核糖體裝配紊亂,隨后通過uL5/uL18介導的p53激活導致細胞凋亡。單獨恢復谷氨酰胺通過觸發uL5/uL18翻譯激活p53。谷氨酰胺對uL5/uL18蛋白合成的誘導依賴于翻譯因子真核延伸因子2 (eEF2),后者又依賴于Raf/MEK/ERK信號傳導。剝奪細胞的谷氨酰胺可防止rRNA合成抑制劑激活p53。我們的數據揭示了一種機制,腫瘤細胞可以利用這種機制在環境養分有效性波動期間抑制p53介導的凋亡。

介紹

實體瘤超過了它們的血液供應,并形成缺氧和缺乏營養的組織微環境1,2。這種微環境的特征是慢性缺氧,并且通常位于距離血管180米以上的地方3,4。另一種類型的缺氧——稱為“循環缺氧”——源于未成熟脈管系統的短暫關閉,可導致“復氧損傷”,即自由基合成增加導致氧化應激和組織損傷5,6。隨著缺氧,不穩定的血液供應也導致腫瘤微環境中營養可用性的大幅波動7。營養剝奪嚴重抑制腫瘤細胞增殖,但選擇顯示增加的血管生成和轉移能力的侵襲性細胞8,9.

為了在代謝應激期間保持能量平衡,腫瘤細胞進化出適應性機制,以減弱營養缺乏下消耗ATP的過程10,11,12。這些適應包括抑制蛋白質合成,這是細胞中最耗能的過程12。例如,真核延伸因子2激酶(eEF2K)在營養限制下被激活并抑制翻譯延伸因子eEF2,從而抑制整體蛋白質合成并促進營養耗盡下的細胞存活2。代謝應激抑制哺乳動物雷帕霉素復合物1的靶標13。這通過激活eIF4E結合蛋白1 (4E-BP1)來抑制帽結合翻譯起始因子eIF4E,從而削弱mRNA翻譯起始13。營養脅迫還觸發整合應激反應(ISR),導致翻譯因子eIF2α失活,從而抑制翻譯起始并促進包括ATF4在內的脅迫適應性蛋白的合成14。另一個關鍵的適應是RNA聚合酶I (Pol I)對rRNA合成的抑制,它占總細胞轉錄的60%15,16。mTORC1和AMP活化蛋白激酶(AMPK)通過磷酸化TIF-IA相互調節前rRNA生物合成,后者是將Pol I錨定在rDNA啟動子上的蛋白質復合物15,16。雖然對營養剝奪的致癌適應已經被很好地表征,但是還不知道饑餓的腫瘤細胞如何在營養恢復后恢復增殖能力。

核糖體生物發生是一個高度復雜的途徑,需要產生4個rRNAs和80個核糖體蛋白17,18。數百種蛋白質反式-作用因子和小核仁RNA有助于裝配過程17,18。該過程始于核仁,在核仁中Pol I合成一個長的多順反子前rRNA,它經歷快速折疊、修飾、加工和與核糖體蛋白結合19,20。在未受應激的細胞中,腫瘤抑制因子p53通過由MDM2(人類中的HDM2,以下表示為MDM2)促進的組成型蛋白酶體降解而保持在低水平21。當核糖體生物合成受到損害時,核糖體成分自由積累,包括核糖體蛋白uL5(以前稱為RPL11)和uL18 (RPL5),它們與5S rRNA一起形成穩定的三聚體復合物,結合并抑制MDM2,導致p53穩定和隨后的p53介導的細胞周期停滯或凋亡22,23,24.

鑒于核糖體生物發生在癌細胞生長中的重要性,已經開發了高效的第一類Pol I抑制劑,如CX-5461和BMH-21,以阻斷rRNA合成并穩定p5325,26。這些抑制劑具有穩定p53而不誘導嚴重DNA損傷的優點,這優于主要的基因毒性化療。令人驚訝的是,盡管核糖體生物發生對所有細胞類型都很重要,但CX-5461的單藥治療已被證明對p53野生型血液惡性腫瘤比p53野生型實體瘤更有效25,27,28,29。值得注意的是,CX-5461已顯示出對選定的實體瘤細胞系具有抗腫瘤活性30。然而,由于缺乏證明體內靶向藥物活性(前rRNA耗竭,p53穩定)的數據,尚不完全清楚抗腫瘤活性是由于靶向效應還是繼發效應。

在這里,我們報告營養剝奪嚴重損害前rRNA加工,并導致未加工rRNA的積累。在營養物再補料時,蛋白質合成恢復,新合成的核糖體蛋白質(包括uL5/uL18)與儲存的前rRNAs結合用于核糖體裝配。在營養缺乏的情況下不能積累前rRNAs導致細胞致死性p53穩定,這是由uL5/uL18介導的MDM2抑制引起的。我們還表明,uL5/uL18對p53的激活依賴于谷氨酰胺的可用性。谷氨酰胺通過激活Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導介導未裝配uL5/uL18的產生,這抑制eEF2K以允許整體eEF2介導的翻譯。我們的研究將前rRNA積累確定為一種機制,通過這種機制,細胞在環境養分可用性波動期間保持存活。最后,我們發現谷氨酰胺的缺乏阻止了rRNA合成抑制劑對p53的激活,這強烈表明谷氨酰胺缺乏的實體瘤對靶向Pol I的小分子表現出固有的抗性。

結果

營養剝奪上調前rRNA表達

我們首先試圖通過Pol I了解營養應激如何影響前rRNA合成速率。我們使用5-氟尿苷(5FU)標記試驗來測量新生前rRNA合成(見“方法”)。5FU是摻入新生RNA的核苷類似物,然而,由于大多數新合成的RNA是前rRNA,5FU標記主要發生在核仁中(補充圖。1a).值得注意的是,該試驗測量前rRNA合成的速率(。Pol I活性)而不是總的前rRNA表達。為了研究營養應激,一組細胞系(結腸直腸HCT116、黑色素瘤A375、肺腺癌A549、骨肉瘤U2OS、胃MKN45)在缺乏葡萄糖、氨基酸和血清的培養基中培養。饑餓24小時后,用5FU脈沖細胞并進行免疫熒光處理。在所有測試的細胞系中,營養剝奪(ND)顯著抑制5FU摻入(圖。1a).因此,Pol I介導的前rRNA合成被代謝應激取消。

圖1:營養剝奪上調前rRNA表達。
figure 1

a營養剝奪下的5FU標記(24小時)。癌細胞系在ND(-葡萄糖-氨基酸FBS)下培養24小時,通過5FU代謝標記測量前rRNA合成。數據代表三幅圖像的平均值±SD。P值(從左到右):< 0.0001,2 × 10?4, <0.0001, <0.0001, 0.0001 (???p?<?0.001; ????p?<?0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA). Scale bar, 10 μm. brRNA前處理示意圖。47S加工產生成熟為18S、28S和5.8S rRNAs的中間前體。初級47S前rRNA包含兩個外部轉錄間隔區(5’ETS和3’ETS)和兩個內部轉錄間隔區(ITS1和ITS2)。c左:使用northern印跡(ITS1探針)在用CX-5461或ND處理的HCT116中的前rRNA表達。右圖:響應CX-5461(10 M) /ND的47S/45S和30S中間體的定量完整的northern印跡顯示在補充圖中。1b. d左:使用northern印跡(ITS1探針)在用CX-5461或ND處理的3T3-L1細胞中的前rRNA表達。右圖:根據CX-5461/ND對47S/45S和34S中間體進行定量。完整的northern印跡顯示在補充圖中。1c. eCX-5461 (10 M,8 h)暴露后前rrna(47S/45S/30s物種)的表達。數據代表平均值±標準差n= 5次技術復制。P值(從左到右):< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001(???p?<?0.0001, statistical analysis by one-way ANOVA). f使用qRT-PCR評估24小時后HCT116、A549、U2OS和MKN45細胞中前rrna(47S/45S/30S物種)的表達。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P值(從左到右):0.0132,0.0213,0.0115,0.0040(?p?<?0.05; ??p?<?0.01, statistical analysis by two-way ANOVA).

我們接下來測試了ND對每個前rRNA物種表達的影響(圖。1b).HCT116細胞接受ND處理24小時,通過northern印跡分析前rRNA表達。Pol I抑制劑CX-5461用作抑制前rRNA合成的陽性對照。正如所料,CX-5461在2小時內迅速耗盡了所有前rRNA中間體的表達(圖。1c).這種急性效應是由于前rRNAs的半衰期短(約30分鐘),而這又是由快速加工引起的30。令人驚訝的是,盡管ND對前rRNA合成有抑制作用,但大前體(47S,45S)的表達在24小時ND后并沒有減少(圖。1c).ND還誘導下游30S物種的強烈上調約兩倍(圖。1c).其他前體(21S,18S-E)在ND處理24小時后輕微下調,但沒有降低到在CX-5461處理的細胞中觀察到的程度(圖。1c,補充圖。1b).類似地,在小鼠3T3-L1成纖維細胞中,ND不影響47 S/45S水平,并上調34S中間體(相當于人類30S)(圖。1d).總之,這些結果表明在ND條件下抑制前rRNA合成不會導致前rRNA表達降低。

我們接下來使用qRT-PCR來定量ND對前rRNA水平的影響。假設30 S中間體被ND上調(圖。1c),我們選擇了測量47S、45S和30S前體總豐度的引物。這些引物跨越前rRNA的5′-外部轉錄序列(5′ETS)的切割位點結合(補充圖。1d).CX-5461顯著降低前rRNA表達(圖。1e).相反,24小時ND顯著上調HCT116、A549和MKN45細胞中的前rRNA水平(圖。1f).

前rRNA加工在ND下受損

我們假設ND下rRNA前體水平上調是rRNA前體加工受損的直接結果。我們用了L-(甲基-3h)-甲硫氨酸代謝標記試驗來評估前rRNA加工31。對照和ND HCT116細胞用L-(甲基-3h)-甲硫氨酸30分鐘,然后用過量的冷甲硫氨酸追趕(圖2a).L-(甲基-的成熟3在對照細胞中,大前體(47S,45S)和下游中間體(32S,30S)的表達隨時間快速下降,表明這些前體代謝成成熟的18S/28S rrna(圖。2a).相反,釹導致47S、45S、32S和30S前體的大量積累(圖。2a),證明這些中間體沒有成熟為18S/28S rrna。因此,18S和28S rRNAs的產生在nd下受到嚴重損害(圖。2b).值得注意的是,將非必需氨基酸谷氨酰胺單獨添加回饑餓細胞中,完全挽救了18S和28S rRNA的產生(圖。2b).這表明在營養恢復過程中,積累在ND下的未加工rRNAs被用于核糖體生物合成。

圖2:前rRNA加工在ND下受損。
figure 2

a對照或ND HCT116細胞中前rRNA加工動力學分析。經3.5小時ND預處理的HCT116細胞隨后用L-(甲基-3H)-甲硫氨酸脈沖標記30分鐘,并用過量的冷甲硫氨酸追趕。為了評估營養物恢復對在ND下積累的前rRNAs的影響,在冷甲硫氨酸追逐后2 h,將Gln加回到ND培養基中(“ND + Gln”)。b圖1中28S/18S帶的定量分析。1f(如紅色三角形所示)。2 h時間點的黑色箭頭表示向饑餓(ND)細胞中加入谷氨酰胺的時間。c使用qRT-PCR評估,ND增加rRNA前半衰期(λ)。將HCT116細胞用(24小時)ND預處理,用(20米)放線菌素D終止轉錄,并在指定的時間點提取總RNA用于qRT-PCR分析。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P數值(從左到右):0.006,0.0007,3.2 × 10?6 (?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001). dND減緩A375、A549、U2OS和MKN45細胞中前rRNA的加工。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P數值(從左到右):A375,0.00081,7.2 × 10?6,A549,0.0035,9.4 × 10?5,U2OS,0.0015,0.0031,MKN45,0.00025,0.00031(?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001). e使用qRT-PCR測定的HCT116腫瘤前rRNA半衰期。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。f放線菌素D (1.33 mM)瘤內注射后HCT116腫瘤中前rRNAs、18S和28S的表達。數據代表平均值±標準差n= 4次技術復制。P數值(從左到右):6.5 × 10?5,0.20,0.12 (ns,不顯著;?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001). g已建立的HCT116腫瘤的核心和外圍區域的示意圖(大小約為1000 mm3). h使用蛋白質印跡法評估HIF-1α在HCT116外周和核心組織中的表達。i如使用qRT-PCR所確定的,與核心組織相比,外周組織中的前rRNA加工更快。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P值(從左到右):0.046,0.00064,0.00016(?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001).

為了嚴格證實ND減緩前rRNA加工,我們使用qRT-PCR和5’ETS引物測量了前rRNA半衰期(補充圖。1d).使用放線菌素D (20微米)阻斷對照和ND HCT116細胞中的轉錄,并在1小時內監測前rRNA表達(見“方法”)。在對照HCT116細胞中,rRNA前半衰期約為28分鐘,而經歷ND的細胞顯示出明顯更長的半衰期78分鐘(圖。2c).類似地,在A375、A549、U2OS和MKN45細胞中,ND顯著增加rRNA前半衰期至少兩倍(圖。2d).

實體瘤的微環境嚴重缺乏營養,血管化不充分7。因此,我們試圖估計前rRNAs在體內的半衰期。為了研究這一點,我們將高濃度的放線菌素D溶液(1.33 mM)直接注射到HCT116腫瘤中,以急性停止轉錄。注射后,發現腫瘤組織含有> 100微米放線菌素D,表明藥物充分擴散(補充圖。1e).此外,由于Pol I轉錄的抑制導致核仁蛋白轉移到核質,這一過程稱為核仁破壞32,33我們評估了核仁素在腫瘤冰凍切片中的定位。事實上,對照腫瘤顯示了許多完整的核仁素陽性核仁,但放線菌素D治療的腫瘤顯示胞質中的核仁素染色(補充圖。2a).接下來,為了評估前rRNA在體內的穩定性,用放線菌素D瘤內注射HCT116腫瘤并在8小時內收集組織。從組織中提取RNA并通過qRT-PCR分析前rRNA表達。腫瘤前rRNAs的半衰期約為3.8小時(圖。2e).此外,放線菌素D對18S和28S表達沒有顯著影響(圖。2f).其次,由于已經表明實體瘤的核心與外圍相比營養消耗更嚴重34,我們推斷核心腫瘤細胞將顯示比周圍細胞更慢的前rRNA加工動力學。為了測試這一點,大的HCT116腫瘤(> 1000 mm3)注射放線菌素D,并解剖外周和核心組織以分別在高或低營養條件下分化腫瘤細胞(圖。2g)34。核心組織表達較高水平的HIF-1α,與實體瘤核心區域缺氧的概念一致(圖。2h).此外,代謝組學分析顯示,核心組織的幾種代謝物水平明顯較低,包括谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸和組氨酸(補充圖。2e).最后,與我們的假設一致,外周前rrna的半衰期為3.5小時,而核心前rrna的半衰期明顯更長,為8.3小時(圖。2i).

rRNA前積累是對營養恢復的適應性反應

因為在營養(谷氨酰胺)反饋期間,ND下積累的前rRNAs被用于核糖體生物合成(圖。2b),我們假設前rRNA積累可能對營養恢復期間核糖體裝配的恢復很重要。為了解決這個問題,我們測試了在ND條件下抑制前rRNA表達是否會導致代謝恢復過程中核糖體裝配紊亂。首先,為了防止前rRNA積累,將HCT116或A375細胞置于ND下,用賦形劑、CX-5461或BMH-21(第二種Pol I抑制劑)共同處理。用CX-5461或BMH-21抑制前rRNA合成有效地阻斷了ND下前rRNA的積累(圖。3a).值得注意的是,ND單獨引起大量細胞死亡,但這并沒有因CX-5461或BMH-21聯合治療而加劇(圖。3b).接下來,為了誘導代謝恢復,將“前rRNA耗盡”細胞(ND + CX-5461或ND + BMH-21)轉移到無藥物的營養豐富的培養基中8小時(圖。3c).通過評估未裝配核糖體蛋白的表達來評估核糖體裝配的保真度,未裝配核糖體蛋白在有缺陷的核糖體生物發生時積累35。為了評估無核糖體蛋白質,使用蔗糖緩沖超速離心去除蛋白質裂解物中的大核糖體,并通過蛋白質印跡分析所得的無核糖體裂解物(圖。三維(three dimension的縮寫)).我們重點研究了關鍵核糖體蛋白uL5(以前稱為RPL11)和uL18 (RPL5)的表達,因為這兩種蛋白已被證明在核糖體生物合成受損時特異性積聚在無核糖體部分35。在接受營養恢復(NR)的ND載體細胞中未檢測到無核糖體uL5/uL18,表明新翻譯的uL5/uL18在代謝恢復期間有效地整合到核糖體中(圖。3e).相反,未裝配的uL5/uL18在經歷NR的前rRNA缺失細胞(ND + CX-5461)中表達(圖。3e).這表明這些核糖體蛋白沒有整合到核糖體中。此外,用環己酰亞胺(CHX)終止翻譯防止了未裝配uL5/uL18的積累(圖。3e).這與提出的模型一致,即未裝配的uL5/uL18的積累需要持續的蛋白質合成35。我們進一步評估了受干擾的核糖體裝配是否與核仁破壞有關。事實上,核仁素存在于暴露于NR的rRNA缺失前細胞的核質中,而染色僅限于對照組細胞的核仁(補充圖。3a).

圖3:前rRNA積累是對營養恢復的適應性反應。
figure 3

a用載體處理后的前rRNA表達(NaH24),CX-5461 (10米),或BMH-21 (1米)在24小時內。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P數值(從左到右):HCT116,< 0.0001,< 0.0001,A375,< 0.0001,< 0.0001,采用雙向ANOVA進行統計分析。b在對照或含載體(NaH)的ND培養基中培養的HCT116細胞中的細胞死亡百分比24),CX-5461 (10 M)或BMH-21 (1 M),如使用臺盼藍排斥試驗所評估的。數據代表平均值±標準差n= 3次生物復制。(ns:不顯著)。P數值(從左到右):ND,< 0.0001,< 0.0001,采用雙向ANOVA進行統計分析。c顯示ND和營養恢復(NR)處理的示意圖。為了抑制前rRNA的表達,首先將HCT116或A375細胞置于有載體、CX-5461或BMH-21存在的ND下。用ND + CX-5461 (10 M)/ND + BMH-21 (1 M)預處理的細胞代表“前rRNA-耗盡”細胞。為了誘導代謝恢復,用PBS洗滌預饑餓的細胞三次,并使其在無藥物的DMEM (10% FBS)中靜置。d為了評估無核糖體蛋白的表達,使用蔗糖緩沖超速離心澄清輸入裂解物中的大核糖體。使用蛋白質印跡分析所得的不含核糖體的裂解物。e代謝恢復的HCT116細胞中無核糖體r蛋白的表達。fNR誘導rRNA缺失前的HCT116和A375細胞死亡。在NR 24小時后拍攝代表性的顯微鏡圖像。比例尺,100 μmg使用臺盼藍排斥試驗測定的代謝恢復細胞的細胞死亡百分比。數據代表平均值±標準差n= 3次生物復制。P-值(從左到右):HCT116,< 0.0001,< 0.0001,A375,< 0.0001,< 0.0001,通過雙向ANOVA進行統計分析。hNR誘導rRNA缺失前細胞的凋亡,這被泛半胱天冬酶抑制劑zVAD-FMK (1 M)抑制。i在CX-5461 (10 M)/BMH-21 (1 M)藥物洗脫和NR后,rRNA前體合成恢復。數據代表平均值±標準差n= 3個獨立的圖像。P數值(從左到右):0.077,0.0422,用雙向ANOVA進行統計分析。比例尺,10 μm。用于a, b, g, i,ns,不顯著;?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001; ????p?<?0.0001.

為了評估核糖體裝配受損的后果,將去除了前rRNAs的細胞暴露于延長的NR (24小時),并使用光學顯微鏡初步評估細胞恢復。饑餓對照(ND +載體)HCT116和A375細胞在NR后恢復增殖,如匯合增加所示。與此形成鮮明對比的是,暴露于NR的饑餓的前rRNA耗盡的細胞沒有恢復增殖,并且進一步表現出凋亡的特征,例如細胞尺寸減小和形態變圓(圖。3f).臺盼藍排斥試驗揭示了經歷NR的前rRNA缺失細胞中細胞死亡的深度水平,但對照細胞中沒有(圖。3g).裂解的胱天蛋白酶-3和PARP的存在表明NR介導的細胞死亡是凋亡,其檢測通過加入泛胱天蛋白酶抑制劑zVAD-FMK而消除(圖。3h).此外,我們觀察到前rRNA缺失的細胞在NR上恢復前rRNA合成(圖。3i),表明CX-5461和BMH-21的作用是可逆的。綜上所述,這些結果表明,在ND條件下未能積累前rRNAs導致NR期間核糖體亞單位裝配紊亂和細胞凋亡。

核仁監視驅動NR介導的細胞凋亡

核糖體裝配的破壞導致未裝配的uL5/uL18積聚并以抑制方式與MDM2結合,導致p53的穩定和p53依賴性凋亡的激活22,23,24,25,35,36,37。被稱為核仁監視途徑,我們假設這種模式的細胞死亡是NR誘導rRNA缺失前細胞凋亡的主要機制。與此一致,接受NR處理的前rRNA缺失(ND + CX-5461/ND + BMH-21)細胞積累了高水平的p53,而這在饑餓的載體(ND +載體)細胞中沒有觀察到(圖。4a,補充圖。3b).值得注意的是,p53在ND + CX-5461或ND + BMH-21下不穩定,可能是由于uL5/uL18翻譯減少(補充圖。3c).我們接下來免疫沉淀MDM2來評估相關uL5/uL18的表達。MDM2在對照ND細胞中檢測不到,但在暴露于NR的前rRNA缺失細胞中上調(圖。4b).這種上調是由于MDM2是p53的下游轉錄靶標。重要的是,在前rRNA缺失的細胞中,MDM2的沉淀顯示高水平的免疫共沉淀uL5/uL18(圖。4b).

圖4:核仁監視驅動NR介導的凋亡。
figure 4

a使用蛋白質印跡法評估NR誘導rRNA缺失前HCT116細胞中的p53。bp53、uL5和uL18與MDM2的免疫共沉淀。csiRNA對uL5和uL18的雙重敲低抑制了NR介導的p53和凋亡標記的激活。dNR誘導HCT116 p53+/+細胞凋亡,但不誘導p53-細胞凋亡。e使用膜聯蛋白V-PI流式細胞儀測定,NR誘導rRNA缺失前的HCT116 p53+/+細胞凋亡,但不誘導HCT 116 p53-細胞凋亡。數據代表平均值±標準差n= 3次技術復制。P值(從左到右):p53+/+,7.6 × 10?7, 7.9 × 10?5、p53、< 0.0001、< 0.0001 (ns,不顯著;????p?<?0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA). f(I)rRNA前體中間體在營養缺乏的癌細胞中積累。同時,ND抑制全局mRNA翻譯。營養添加(NR)后,積累的前rRNAs被新翻譯的uL5和uL18結合,進行核糖體裝配。(II)用CX-5461 (1 M)治療防止癌細胞在ND下積累前rRNAs。NR后,在缺乏內源性前rRNAs的情況下,uL5和uL18結合MDM2,導致p53穩定和營養誘導的凋亡。

我們接下來測試了損害uL5/uL18依賴的核仁監視通路是否可以減輕NR介導的凋亡。因此,我們使用兩組獨立的siRNAs對uL5和uL18進行了雙重敲除,并評估了p53和凋亡標記的激活。uL5和uL18的雙重缺失完全阻斷了p53的穩定,并大大減少了PARP和Caspase 3的裂解(圖。4c).同樣,uL5和uL18的雙重敲除也降低了A375和A549細胞中NR介導的p53活化(補充圖。三維(three dimension的縮寫)).單獨沉默uL5或uL18也強烈抑制p53(補充圖。3e).使用p53野生型或敲除的HCT116細胞獲得了對p53在NR介導的凋亡中的作用的進一步支持。與野生型細胞相比,暴露于NR的rRNA前缺失的HCT116 p53細胞表現出較低水平的凋亡,如凋亡標記物和膜聯蛋白V染色活性降低所示(圖。4d,e).最后,靶向p53或PUMA(p53的下游效應子)的siRNAs也強烈減輕了HCT116和A375細胞中NR誘導的凋亡(補充圖。4a–c,5a).

總之,這些數據表明,癌細胞在饑餓狀態下積累未加工的rRNAs,以逃避營養物再供給過程中p53介導的凋亡(圖。4f).饑餓期間積累的前rRNAs在代謝恢復時用于核糖體生物合成(參見脈沖追蹤標記圖)。2a,b).饑餓狀態下未能積累前rRNAs導致未裝配的uL5/uL18與MDM2結合,導致營養誘導的p53介導的凋亡(圖。4f).

谷氨酰胺通過誘導uL5/uL18翻譯代謝激活p53

p53通過核仁監視途徑的激活需要uL5和uL18持續的從頭蛋白質合成35,38。因此,p53的積聚作為活性uL5/uL18 mRNA翻譯的替代標記。鑒于此,我們發現單獨恢復谷氨酰胺就足以拯救rRNA缺失前的HCT116和A375細胞中的p53(圖。5a,補充圖。5b).相反,亮氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的恢復對p53沒有影響(補充圖。5c).此外,uL5/uL18的雙重敲除抑制了谷氨酰胺對p53的激活(補充圖。5d).這些結果表明,谷氨酰胺通過誘導uL5/uL18蛋白合成,在rRNA前耗竭的細胞中代謝激活p53。最后,谷氨酰胺恢復也重新激活了mTORC1,如已知的mTORC1底物S6K (Thr 389)磷酸化的增加所示(圖。5a).這一發現與谷氨酰胺在激活mTORC1中的作用一致39,40。這促使我們研究mTORC1是否是p53代謝穩定所必需的。為了測試這一點,在雷帕霉素或Torin1(兩種高效和特異性的mTORC1抑制劑)存在下,將rRNA前缺失的細胞重新喂食谷氨酰胺。然而,雷帕霉素或Torin1對p53沒有抑制作用(圖。5b).因此,我們想知道調節蛋白質合成的其他途徑,如Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯,是否可以調節谷氨酰胺介導的uL5/uL18的合成。為了支持這一點,谷氨酰胺修復拯救了rRNA缺失前A375細胞中的MEK和ERK磷酸化(圖。5c).為了測試p53的代謝穩定性是否依賴于Raf/MEK/ERK信號傳導,將預先rRNA缺失的細胞重新喂食谷氨酰胺和泛Raf抑制劑LY3009210 (400 nM)或AZ628 (500 nM)。引人注目的是,兩種pan-Raf抑制劑都阻斷了谷氨酰胺對p53的激活(圖。5d).正如所料,LY3009210或AZ628治療強烈降低ERK和MEK磷酸化(圖。5d).

圖5:谷氨酰胺通過誘導uL5/uL18翻譯代謝激活p53。
figure 5

a通過蛋白質印跡評估,谷氨酰胺(gln)激活rRNA前體缺失的HCT116細胞中的p53。HCT116在含有載體(NaH)的ND培養基中培養24),CX-5461 (10 M)或BMH-21 (1 M)培養24小時。24小時后,用含有PBS或Gln (4 mM)的ND培養基替換舊的處理培養基8小時b用雷帕霉素(1 M)或Torin1 (1 M)抑制mTORC1不會降低谷氨酰胺對p53的穩定作用。c谷氨酰胺恢復拯救rRNA缺失前A375細胞的MEK和ERK磷酸化。d用LY3009210 (400 nM)或AZ628 (500 nM)抑制Raf抑制了谷氨酰胺(gln)對p53的代謝活化。e示意圖:谷氨酰胺恢復激活Ras/Raf/MEK/ERK信號,抑制eEF2K。抑制eEF2K后,eEF2保持其活性形式以促進整體蛋白質合成(包括uL5/uL18翻譯)。Raf/MEK/ERK的藥理學抑制導致eEF2k激活,進而磷酸化和滅活eEF2。f抑制MEK (10 M U0126,50 M PD98059)或ERK (1 M LY3214996,0.1 M GDC-0994)抑制谷氨酰胺(gln)對p53的代謝激活。g抑制Raf (400 nM LY3009210)、MEK (10 M U0126)和ERK (1 M LY3214996)抑制A375細胞中谷氨酰胺(gln)對p53的代謝激活。h多聚體結合的r蛋白mRNAs的表達。將HCT116細胞置于ND下24小時。24小時后,用含有4 mM Gln、LY3009210 (400 nM)或Gln + LY3009210的ND培養基替換舊的處理培養基。通過在40%蔗糖緩沖液上超速離心收集多聚體,提取總RNA并使用qRT-PCR分析uL5、uL18、uL23和S3。數據代表平均值±標準差n= 4次技術復制。P-值(從左到右):uL5、< 0.0001、0.0003、< 0.0001、uL18、< 0.0001、0.0052、uL23、< 0.0001、0.0003、< 0.0001、S3、< 0.0001、< 0.0001、< 0.0001(??p?<?0.01; ???p?<?0.001; ????p?<?0.0001, statistical analysis by two-way ANOVA).

我們接下來試圖了解ERK信號對uL5/uL18翻譯的潛在調節作用。假定mTORC1主要調節翻譯起始41,且mTORC1抑制不抑制p53(圖。5b),我們推斷ERK可能通過翻譯的延伸步驟調節uL5/uL18。事實上,在非應激細胞中,ERK通過抑制真核延伸因子-2激酶(eEF2K)促進mRNA翻譯,eEF2K是蛋白質合成的關鍵負調節因子(圖。5e)42,43。eEF2K抑制后,其下游靶真核延伸因子-2 (eEF2)保持其活性非磷酸化形式,以介導整體翻譯延伸(圖。5e)42,43。因此,我們假設uL5/uL18翻譯依賴于ERK介導的eEF2激活(圖。5e).因此,我們檢測了eEF2磷酸化水平;磷酸化的eEF2 (Thr56)是失活形式,導致一般蛋白質合成的停滯42,43。用LY3009210或AZ628抑制Raf增加了饑餓對照組和rRNA缺失前細胞的eEF2磷酸化(圖。5d).我們還測試了抑制下游激酶MEK和ERK是否會對eEF2和p53產生同樣的作用。MEK (U0126,PD98059)或ERK (LY3214996,GDC-0994)的藥理學抑制同樣誘導eEF2磷酸化和p53抑制(圖。5f).同樣,在A375細胞中,Raf (LY3009210)、MEK (U0126)和ERK (LY3214996)的抑制完全阻斷了p53的表達(圖。5g).接下來,為了評估Raf抑制對uL5/uL18 mRNA翻譯的影響,我們測量了翻譯活性多聚體結合mRNA的表達(見“方法”)。ND單獨降低了多聚體結合的uL5/uL18 mrna的比例(圖。5h).重要的是,谷氨酰胺恢復拯救了uL5/uL18 mRNA翻譯,但通過與LY3009210共孵育而被抑制(圖。5h).與eEF2在一般mRNA翻譯中的作用一致42,43,用uL23和S3多聚體結合的mRNAs觀察到類似的效果(圖。5h).

谷氨酰胺剝奪通過阻斷核仁監視途徑賦予癌細胞對RNA Pol I抑制劑的抗性

因為谷氨酰胺恢復穩定了前rRNA缺失細胞中的p53(圖。5a),我們接下來測試了谷氨酰胺剝奪對CX-5461激活p53的影響。引人注目的是,谷氨酰胺的缺乏阻斷了1微米CX-5461對p53的激活,而葡萄糖或其他氨基酸的缺乏沒有影響(圖。6a,補充圖。6a).谷氨酰胺剝奪不會抑制MDM2抑制劑AMG 232對p53的穩定作用(補充圖。6b).通過測量p21 mRNA證實了谷氨酰胺缺乏時p53轉錄活性的抑制(補充圖。6c).p53的抑制不是由于uL5/uL18翻譯的減少,因為谷氨酰胺的缺乏沒有顯著抑制uL5/uL18新生蛋白的合成(補充圖。6d).有趣的是,在谷氨酰胺缺乏的情況下,1微米CX-5461不能降低前rRNA的表達(補充圖。6e),然而,將劑量增加到10微米挽救了前rRNA抑制和p53激活(補充圖。6f,g).在對照條件下,CX-5461導致uL5/uL18與MDM2免疫共沉淀,但在谷氨酰胺缺乏的條件下則沒有(補充圖。6小時).谷氨酰胺剝奪抑制了BMH-21和另外兩種Pol I抑制劑CX-3543和放線菌素D對p53的激活(圖。6b).谷氨酰胺剝奪也抑制A375、A549、U2OS、LNCaP和MKN45細胞中的p53(圖。6c),并賦予HCT116細胞對CX-5461的抗性(圖。6d)以及LNCaP和MKN45細胞(補充圖。7a).葡萄糖剝奪,不抑制p53,不賦予CX-5461抗性(圖。6d).谷氨酰胺剝奪下p53的過度表達挽救了CX-5461的生長抑制作用(補充圖。7b).此外,用非基因毒性MDM2抑制劑AMG 232拯救p53也抑制了谷氨酰胺缺乏細胞的生存力(補充圖。7c).

圖6:谷氨酰胺剝奪通過阻斷核仁監視途徑賦予癌細胞對RNA Pol I抑制劑的抗性。
figure 6

a谷氨酰胺剝奪通過CX-5461治療抑制p53的激活。HCT116細胞在各自的饑餓培養基中培養16小時,然后用CX-5461 (1 M)培養8小時b谷氨酰胺的缺乏抑制了BMH-21 (1 M)、CX-3543 (1 M)和ActD對p53的激活,如通過蛋白質印跡所評估的。c谷氨酰胺剝奪抑制A375、A549、U2OS、LNCaP和MKN45細胞中CX-5461 (1 M)對p53的激活。d如使用MTT試驗所評估的,谷氨酰胺而非葡萄糖的剝奪賦予了對CX-5461 (1 M)的抗性。每個處理的數據點被標準化為各自的載體處理的代謝對照。數據代表平均值±標準差n= 6次生物復制。e通過蛋白質印跡評估,CX-5461對p53的激活在0.4 mM谷氨酰胺下被抑制。fCX-5461不能抑制HCT116腫瘤的生長。給小鼠口服賦形劑(NaH2PO4)、CX-5461 (50毫克/千克)或AMG 232 (50毫克/千克),每天一次,每周三次。在大約75 mm的腫瘤上植入后5天開始藥物治療3。數據代表平均值SEMn= 8只小鼠/組。P值:車輛/CX-5461,0.078,車輛/AMG 232,2.4 × 10?4 (?p?<?0.05; ??p?<?0.01; ???p?<?0.001). gCX-5461不能急性穩定HCT116腫瘤中的p53。給小鼠IP注射賦形劑(NaH2PO4)、CX-5461 (50、100、200毫克/千克)或AMG 232 (50毫克/千克),8小時后收獲腫瘤用于蛋白質印跡分析。(h)載體或藥物IP給藥后A375腫瘤中的p53 IHC染色。比例尺代表50米

由于被腫瘤細胞快速消耗,實體瘤含有低水平的谷氨酰胺34。因此,我們預測CX-5461在體內不能穩定p53。事實上,p53在0.4 mM谷氨酰胺下被抑制(圖。6e),這大約是在腫瘤異種移植物中發現的谷氨酰胺濃度34。我們選擇HCT116作為我們的模型細胞系,因為CX-5461已經顯示在IC50為167 nM時有效抑制HCT116體外細胞增殖30。最高長期耐受劑量(50毫克/千克)的CX-5461的口服管飼未能顯著抑制腫瘤生長(圖。6f).我們使用AMG 232作為p53介導的腫瘤抑制的陽性對照。以與CX-5461相同的劑量和方案口服灌胃AMG 232 (50毫克/千克)顯著抑制HCT116腫瘤生長(圖。6f).此外,對HCT116腫瘤IP注射高達200 mg/kg的CX-5461不能激活p53,而AMG 232 (50 mg/kg)強烈誘導p53(圖。6g).類似地,AMG 232而不是CX-5461穩定了A375腫瘤中的p53(圖。6小時).這些結果表明,腫瘤谷氨酰胺缺乏通過阻斷p53依賴的核仁監視途徑而阻礙Pol I抑制劑的抗腫瘤活性。

討論

實體瘤中不穩定的脈管系統導致營養有效性波動的組織微環境的發展7。駐留在這種環境中的腫瘤細胞通過抑制大量利用ATP的過程(如核糖體生物發生)來適應營養耗盡10,11,12,但營養恢復過程中細胞如何恢復仍有待闡明。在這里,我們報道了代謝應激的哺乳動物細胞積累未加工的rRNAs,以逃避營養應激終止時的核仁監視。我們首先觀察到ND抑制前rRNA加工,導致營養缺乏細胞中前rRNA中間體的積累。在營養恢復時,恢復中的細胞恢復核糖體生物合成,并且在脅迫期間積累的前rrna轉化為成熟rrna。在ND下未能積累前rRNAs的細胞在營養物再供給期間經歷細胞致死性p53激活。從機理上講,p53被未裝配的uL5/uL18結合并抑制MDM2而激活。我們的數據表明,營養剝奪期間的前rRNA積累是一種應激適應,在營養可用性波動期間抑制uL5和uL18的MDM2結合活性。

在這篇手稿的制備過程中,據報道CX-5461對拓撲異構酶II具有額外的抑制活性44,45。由于我們使用CX-5461來抑制ND條件下的前rRNA積累,這給我們的論文帶來了限制。我們通過在實驗中使用BMH-21和CX-5461來解決這一限制。

我們進一步確定p53通過uL5/uL18依賴的核仁監視途徑的激活依賴于外源性谷氨酰胺。在耗盡前rRNAs的預饑餓細胞中,重新喂食谷氨酰胺足以穩定p53,與uL5/uL18翻譯的拯救相一致。令人驚訝的是,盡管已知mTORC1在5’頂端mRNAs(編碼包括uL5和uL18在內的核糖體蛋白)的翻譯控制中的重要性46,47雷帕霉素或Torin1處理不影響谷氨酰胺對p53的穩定作用。因為p53蛋白的積累是uL5和uL18合成的標志35,38這一觀察表明uL5/uL18翻譯不僅僅依賴于mTORC1。相反,我們發現藥物抑制Raf/MEK/ERK完全阻斷了p53的積聚。Raf/MEK/ERK抑制似乎通過滅活eEF2來阻止uL5和uL18的合成??傊?,這些結果表明谷氨酰胺誘導的uL5和uL18的合成受到Ras/Raf/MEK/ERK-eEF2K-eEF2軸的促進。

最后,我們發現谷氨酰胺的剝奪通過阻斷p53的穩定化而賦予對CX-5461的抗性。這一發現在體內得到了支持,其中CX-5461不能穩定p53,這可以解釋對HCT116腫瘤生長幾乎沒有抑制作用,特別是考慮到報道的低谷氨酰胺腫瘤微環境34。與我們的發現一致,另一項研究觀察到p53野生型HCT116腫瘤對CX-5461高度耐藥48。盡管另一項研究表明HCT116細胞在體外對CX-5461非常敏感30。因此,這些結果表明,由于腫瘤谷氨酰胺缺乏,CX-5461對實體瘤的治療效果有限。值得注意的是,谷氨酰胺剝奪沒有減少uL5/uL18蛋白合成,表明p53抑制機制不依賴于uL5/uL18 mRNA翻譯??傊?,我們的數據表明,腫瘤谷氨酰胺缺乏通過阻斷核仁監視途徑而阻礙Pol I抑制劑的有效性。這些發現解釋了為什么CX-5461的療效與實體瘤類型中p53野生型狀態無關。此外,這些結果可以解釋為什么CX-5461對血液癌癥高度有效25,27,28,29,其中不會發生嚴重的病理性營養缺乏。事實上,血漿谷氨酰胺濃度約為0.8 mM49這比在該研究中發現p53被抑制的濃度高兩倍(圖。4e).此外,由于核糖體生物發生的速率依賴于營養的可利用性,這意味著血液惡性腫瘤細胞比實體瘤細胞具有更高的核糖體生物發生速率,因此更易受Pol I抑制劑的影響。

總之,我們的研究揭示了一個壓力適應程序,在營養有效性波動時抑制p53。未加工rRNAs的積累是一種關鍵的生存機制,饑餓的腫瘤細胞利用這種機制在營養恢復過程中完成代謝恢復。此外,實體瘤不會在Pol I抑制劑的作用下積聚p53,這可以解釋為固有地缺乏谷氨酰胺,突出了腫瘤微環境的代謝狀況如何能夠深刻地影響對核仁功能破壞劑的治療反應。


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