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阻斷甘氨酸利用通過破壞谷胱甘肽平衡抑制多發性骨髓瘤進展

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發表時間:2022-07-15 10:32作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

腫瘤微環境中的代謝物是腫瘤進展的關鍵因素。然而,對多發性骨髓瘤(MM)骨髓(BM)微環境中的代謝特征缺乏了解,限制了我們對MM進展的了解。在這里,我們表明,由于MM細胞分泌的基質金屬肽酶13 (MMP13)介導的骨膠原降解,BM微環境中的甘氨酸濃度升高,而升高的甘氨酸水平與MM進展相關。MM細胞利用通道蛋白溶質載體家族6成員9 (SLC6A9)吸收外源性甘氨酸,隨后參與谷胱甘肽(GSH)和嘌呤的合成。通過SLC6A9敲除抑制甘氨酸利用或用甜菜堿處理抑制MM細胞增殖并增強硼替佐米對MM細胞的作用??傊?,我們確定甘氨酸是多發性骨髓瘤的關鍵代謝調節劑,揭示了控制多發性骨髓瘤進展的分子機制,并為多發性骨髓瘤的治療提供了一個有希望的治療策略。

介紹

多發性骨髓瘤(MM)的特征是骨髓(BM)微環境中的轉化克隆性漿細胞和血液或尿液中的單克隆免疫球蛋白積聚1。我們組和其他組的最新發現表明,遺傳變異和骨髓微環境導致多發性骨髓瘤的惡性進展和抗癌治療耐藥1,2。據報道,腫瘤微環境中的代謝重編程促進了各種類型癌癥中的腫瘤進展3,4,5。最近,我們證明了腸道細菌通過提高MM中BM谷氨酰胺水平來促進MM進展6,表明BM微環境中代謝物水平的改變可以影響MM。

病理變化強烈地影響著代謝特征。腫瘤的發生導致腫瘤微環境中代謝物的改變,這反過來促進了腫瘤的發展7,8,9,10.最近,已經表明腫瘤相關代謝物可以潛在地用于癌癥的臨床診斷和治療。例如,Tan等人發現一組五種血漿代謝物可以作為胰腺癌的非侵入性診斷標記11和陳等報道阻斷果糖利用可減弱急性髓系白血病的增殖和耐藥性12.然而,仍然缺乏對MM BM微環境中代謝物譜的詳細了解。代謝物在MM進展中的作用更是知之甚少。

在這項工作中,我們試圖填補我們在MM代謝物知識方面的空白。我們對來自MM患者和健康供體(HDs)的骨髓液和外周血(PB)血漿進行了代謝組學分析。最后,我們研究了MM誘導的代謝物的改變及其對MM的治療潛力。

結果

甘氨酸在骨髓微環境中上調,并與MM預后不良相關

我們使用來自HDs和MM患者的PB血漿和BM液體進行了非靶向代謝組學研究。用于這些分析的糞便排泄物液體樣本被分為訓練集和驗證集。為了篩選HDs和MM患者之間差異調節的代謝物,我們使用SIMCA-P 14.1軟件和MetaboAnalyst 5.0分析了代謝物的光譜強度。建立了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型,并顯示出在所有數據集中區分多發性骨髓瘤患者和HDs患者的令人滿意的建模和預測能力(圖。1a).閾值小于零的Q2Y截距(模型的預測精度)表示所有集合中的有效模型(補充圖。1a).從這些OPLS-達模型中獲得代謝物的可變重要性投影(VIP)值,以及倍數變化(FC)和p基于光譜的強度,使用MetaboAnalyst 5.0獲得代謝物的-值。詳細的VIP值、FCs和p-補充數據中顯示了代謝物的值1.與HDs相比,MM患者中大多數氨基酸上調,而脂肪酸下調(補充圖。1b).在訓練集和驗證集中,總共有10種代謝物被鑒定為BM液體中的差異代謝物(VIP > 1,FC > 1.2,p?<?0.05). The identified metabolites in BM liquid included glycine, L-脯氨酸、肌酸酐、鳥氨酸、L-谷氨酸,L-纈氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、巖芹酸和亞油酸,其中七種代謝物在鉛血漿中也發生了顯著變化(圖。1b和補充數據2).有趣的是,甘氨酸在BM驗證組和PB血漿中顯示出最高的VIP值,提示在MM中的重要作用。

圖1:甘氨酸在骨髓微環境中升高,并與MM的不良預后相關。
figure 1

a, b(a)來源于MM患者和HDs的BM液體和PB血漿的OPLS-DA評分圖(BM-訓練集:n= 10在HD組,nMM組中= 20;BM-驗證集:n= 11在HD組,nMM組中= 30;PB:n= 26在HD組,nMM組中= 31),和(b)基于VIP、FC和的所有組中的差異代謝物p-value (MetaboAnalyst 5.0軟件,具有不成對的雙面t-測試)。c左圖:HDs衍生的BM液體中甘氨酸的靶向代謝組學分析(n= 31)和新診斷的MM患者(n= 110);右圖:HDs來源的PB血漿中甘氨酸的靶向代謝組學分析(n= 31)和新診斷的MM患者(n= 110).結果表示平均值±SD;不成對的雙面t-已應用測試。d來自BM液體和PB血漿的甘氨酸濃度的相關性(n= 110;雙邊皮爾遜相關分析)。e使用來自HDs和新診斷的MM患者的受試者基于甘氨酸濃度繪制的ROC曲線(n= 110).源數據作為源數據文件提供。

隨后,我們證實,與HDs患者相比,MM患者骨髓液和外周血中甘氨酸濃度顯著升高(圖。1c).同一MM患者外周血和骨髓液中甘氨酸濃度也呈正相關(r2= 0.2197,p?<?0.0001) (Fig. 1d),這意味著甘氨酸是MM潛在的有價值的診斷生物標志物。我們隨后通過制作甘氨酸濃度的受試者操作者特征曲線(ROC)來評估這種可能性。ROC分析顯示,在BM液體和PB血漿中的甘氨酸有效地區分新診斷的MM患者和HDs,曲線下面積(AUC)值分別為1和0.94(圖。1e).為了探索甘氨酸是否在MM中起作用,我們評估了BM甘氨酸濃度和MM臨床特征之間的潛在相關性。我們發現甘氨酸濃度與漿細胞百分比(p= 0.043),杜里-鮭魚(DS)階段(p= 0.018),血清中存在的免疫球蛋白的亞型(p= 0.04),以及貧血(p= 0.008)(表1).這些發現表明甘氨酸與MM患者的不良預后和惡性進展有關。

甘氨酸濃度與多發性骨髓瘤患者臨床特征的相關性。

甘氨酸剝奪抑制體內外骨髓瘤細胞增殖

與代謝分析一致,人MM細胞系(包括ARP1,MM1。s,RPMI-8226,OCI-My5和KMS28-PE)都表現出比GM12878,人B細胞系更高的細胞內甘氨酸濃度(補充圖。2a).此外,甘氨酸轉運蛋白溶質載體家族6,成員9(SLC6A9)在ARP1、OCI-My5和KMS28-PE中的表達,而另一種甘氨酸轉運蛋白(SLC6A5)相對于GM12878細胞并未在所有MM細胞系中觀察到(補充圖。2b).因此,我們假設相對于GM12878對照細胞,MM細胞從培養基中吸收了更多的甘氨酸。

正如所料,在甘氨酸存在下培養的MM細胞系顯示出較高的細胞內甘氨酸濃度(圖。2a),而剝奪外源性甘氨酸顯著抑制了MM細胞的增殖并減少了集落數量(圖。2b,c).為了測試外源性甘氨酸剝奪是否也抑制了體內MM進展,我們給有MM傾向的C57BL/KalwRijHsd小鼠喂食正?;虿缓拾彼岬娘嬍骋恢?,然后靜脈注射表達熒光素酶的5TGM1小鼠骨髓瘤細胞。我們通過整體動物活體成像和測量IgG2b濃度和骨損傷來監測這些小鼠(稱為“5TGM1 MM小鼠”)的MM發展和腫瘤負荷參數(圖。2d).在第6周,對照小鼠的血清甘氨酸濃度遠高于無甘氨酸小鼠的血清甘氨酸濃度(圖。2e).與對照組小鼠相比,在注射5TGM1細胞后第8周,喂食無甘氨酸飲食的小鼠顯示出顯著降低的腫瘤相關發光強度(圖。2f,g).此外,在第4周和第8周,對照小鼠的血清IgG2b濃度顯著高于無甘氨酸小鼠的血清IgG2b濃度(圖。2h).

圖2:外源性甘氨酸的剝奪抑制了體外和體內的MM細胞生長。
figure 2

aARP1,MM1中甘氨酸的靶向分析。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培養基中培養的s和5TGM1細胞。bARP1,MM1的生長曲線。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培養基中培養的s和5TGM1細胞。n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±SD;用不成對的雙側分析顯著性t-測試輸入(a, b). cARP1,MM1的克隆原性分析。在添加或不添加甘氨酸(10毫克/升)的RPMI 1640培養基中培養的s和5TGM1細胞(n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±SD)。d體內實驗示意圖。e來自用對照飲食喂養的5TGM1 MM小鼠的血清中甘氨酸的靶向測定(n= 6在第0周,n= 4在第6周)或無甘氨酸飲食(n=第0周和第6周的6)。f用對照飲食或不含甘氨酸飲食喂養的5TGM1 MM活小鼠中的腫瘤相關發光強度。g在第2、4、6和8周用對照飲食或不含甘氨酸的飲食喂養的5TGM1 MM小鼠中發光強度的量化。h用ELISA檢測小鼠血清中IgG2b的濃度(第0周:n=每組6人,第2周:n=每組6人,第4周:n= 4在控制飲食組中,n= 6在無甘氨酸組,第8周:n= 2在控制飲食組中,n無甘氨酸組中= 6)。i來自用對照飲食或無甘氨酸飲食喂養的5TGM1 MM小鼠的股骨的顯微CT圖像。j量化骨微結構參數,即BV/TV、Tb。n,Tb。Sp和Tb。Th(n=每組5個)。k, l骨吸收標記物CTX-1和骨形成標記物PINP的定量(n= 4在控制飲食組中,n無甘氨酸飲食組= 6)。結果表示平均值±SD;用不成對的雙側分析顯著性t-測試輸入(e, g, h, jl). m用對照飲食或無甘氨酸飲食喂養的5TGM1 MM小鼠的存活曲線(對數秩檢驗)。源數據作為源數據文件提供。

骨損傷是多發性骨髓瘤最重要的特征之一。因此,我們使用micro-CT掃描來檢測小鼠股骨的骨損傷,發現與無甘氨酸小鼠相比,對照組小鼠的股骨小梁骨量明顯較低(圖。2i).骨微結構參數的量化顯示骨小梁體積分數(Tb。BV/TV)和小梁數量(Tb。n)遠低于無甘氨酸小鼠,而小梁分離(Tb。Sp)和小梁板厚度(Tb。Th)與無甘氨酸的小鼠相比在對照小鼠中升高(圖。2j).此外,骨吸收標記物CTX-I(I型膠原的C-末端肽)和骨形成標記物PINP(I型前膠原的N-末端前肽)在骨質疏松癥患者中升高13,進行mcie血清檢測。與不含甘氨酸的小鼠相比,對照小鼠中的CTX-1和PINP均較高,進一步揭示了對照小鼠中更嚴重的骨損傷(圖。2k,l).此外,對存活曲線的分析表明,與對照飲食相比,無甘氨酸飲食顯著延長了小鼠存活時間(圖。2m).因此,外源性甘氨酸剝奪減緩了體內MM的進展。

甘氨酸剝奪通過破壞骨髓瘤細胞內谷胱甘肽平衡抑制細胞增殖

為了探索外源性甘氨酸調節MM細胞增殖的潛在機制,我們在補充了5%透析的FBS和同位素標記的甘氨酸(10 mg/L)的無甘氨酸RPMI 1640培養基中培養ARP1細胞。為了消除天然同位素引起的干擾,在0小時收集的細胞用作分析的參考。然后對細胞進行處理,檢測有或沒有甘氨酸、絲氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸、肌苷-5′-一磷酸(IMP)、鳥苷-5-一磷酸(GMP)、腺苷-5-一磷酸(AMP)、腺嘌呤和鳥嘌呤的水平13c標簽(圖3a).代謝追蹤13C2-甘氨酸表明,在ARP1細胞中甘氨酸被整合到絲氨酸(m + 2)、GSH (m + 1和m + 2)、IMP (m + 2和m + 3)、GMP (m + 2和m + 3)、AMP (m + 2和m + 3)、腺嘌呤(m + 2)和鳥嘌呤(m + 2)中(補充圖。3a).因此,外源性甘氨酸被MM細胞吸收,隨后通過提供碳代謝成這些代謝物(圖。3b).的質量分布向量13還發現c標記的代謝物隨著時間的推移而增加(補充圖。3b–d).為了探索外源性甘氨酸是否通過GSH或嘌呤促進MM細胞中的細胞增殖,我們用補充了GSH (10微米)或次黃嘌呤(50微米)的無甘氨酸培養基培養ARP1細胞,三天后使用比色細胞活力測定(細胞計數試劑盒-8,CCK-8)來測量細胞增殖。如補充圖所示。3eGSH和次黃嘌呤都可以挽救在無甘氨酸培養基中培養的ARP1細胞的增殖。以前的出版物表明,外源甘氨酸有助于黑色素瘤細胞中嘌呤的合成,而不是GSH的合成14.因此,在這項研究中,我們重點研究了來源于外源性甘氨酸的谷胱甘肽在多發性骨髓瘤中的作用。3c),并且增加的外源甘氨酸相應地增加了細胞內GSH水平(圖。三維(three dimension的縮寫)).在5TGM1細胞中觀察到相同的模式(補充圖。3f).增加外源甘氨酸也降低了ARP1和5TGM1細胞中的活性氧(ROS)水平(補充圖。3g).我們進一步發現,在來源于無甘氨酸飲食喂養的異種移植MM小鼠的腫瘤中,GSH水平顯著低于那些來自正常飲食喂養的小鼠(圖。3e).在無甘氨酸小鼠中形成的腫瘤也明顯小于對照組小鼠(補充圖。3h).

圖3:甘氨酸來源的谷胱甘肽有助于MM細胞的增殖。
figure 3

a甘氨酸代謝流實驗示意圖。bMM細胞中甘氨酸代謝示意圖。c在有或沒有GSH的無甘氨酸培養基處理下培養的ARP1細胞的生長曲線。d用不同劑量的甘氨酸培養24小時的ARP1細胞中的GSH水平n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±SD;不成對的雙邊t-測試用于(c, d). e來自用對照飲食或無甘氨酸飲食喂養的B-NDG小鼠的腫瘤結中的GSH水平(n= 3只老鼠;不成對的雙邊t-測試)。f5TGM1 MM小鼠腫瘤相關發光強度的實時成像。g在圖中顯示的5TGM1 MM小鼠群中腫瘤相關發光強度的定量(f). h用ELISA檢測的小鼠血清中IgG2b的濃度(第0周和第2周:n=每組6人,第4周:n= 5在對照組+ GSH組,n= 6在其他組中,第6周:n在對照組和無甘氨酸組中= 6,n= 2在對照組+ GSH組,n= 5在無甘氨酸+ GSH組,p1代表對照組與對照組+ GSH組之間的顯著性,p2代表無甘氨酸組和無甘氨酸+ GSH組之間的顯著性)。結果表示平均值±SD;不成對的雙邊t-測試用于(g, h). i用含有或不含GSH的對照或不含甘氨酸的飲食喂養的5TGM1 MM小鼠的存活曲線(n=每組6個;對數秩檢驗)。j甘氨酸代謝相關基因在有或無甘氨酸培養的ARP1細胞中的表達譜。k甘氨酸代謝示意圖。lγ-H免疫熒光分析的代表性圖像2在有或沒有甘氨酸培養48小時的ARP1細胞中AX(紅色)蛋白的表達(n=每組50張圖像;結果表示平均值±SD;不成對的雙邊t-測試)。mγ-H的蛋白質印跡2AX、p-ATR、p-ATM、p-CHK1、p-CHK2、CDC25A和β-肌動蛋白在加或不加甘氨酸和/或GSH培養48小時的ARP1細胞中的表達。源數據以源數據文件的形式提供。

據報道,GSH合成的抑制抑制了各種類型癌癥中的腫瘤細胞增殖15,16,17.我們發現,通過阻止GSH合成或添加外源性GSH來破壞細胞內GSH平衡會抑制ARP1和5TGM1細胞的增殖(補充圖。3i,j).因此,我們研究了添加GSH是否能恢復喂食無甘氨酸飲食的5TGM1 MM小鼠的腫瘤進展。腫瘤負荷分析顯示,腫瘤相關的發光強度(圖。3f,g)和血清IgG2b濃度(圖。3h)顯著高于對照組小鼠。用GSH處理的小鼠也顯示出顯著縮短的存活時間(圖。3i).因此,GSH作為甘氨酸的下游效應物介導MM進展。

使用有或沒有甘氨酸培養的ARP1細胞的RNA測序顯示SLC6A9,甘氨酸脫羧酶(甘氨酸脫氫酶),絲氨酸羥甲基轉移酶2(SHMT2),以及谷胱甘肽合成酶(穩態測地衛星(Geodetic Stationary Satellite))在外源甘氨酸存在下顯著上調(圖。3j和補充數據3).這表明外源性甘氨酸剝奪誘導了甘氨酸轉運、甘氨酸裂解、甘氨酸和絲氨酸之間的相互轉化以及谷胱甘肽合成的改變,這與甘氨酸代謝流分析一致(圖。3k).基于差異表達基因的富集信號通路分析顯示,前10個富集通路中有一半與細胞有絲分裂和DNA損傷有關(補充圖。3k和補充數據4).隨后的細胞周期和DNA損傷分析顯示,外源性甘氨酸剝奪誘導的S期停滯(補充圖。3l)和γ-H的上調2AX,DNA損傷的標志(圖。3l和補充圖。3m).因為活性氧誘導的DNA損傷可以激活DNA修復途徑,導致細胞周期停滯(補充圖。3n),我們進行蛋白質印跡來檢測γ-H的表達2這些細胞中的AX和DNA修復相關蛋白。我們發現GSH處理降低了γ-H的水平2AX、p-ATR和p-CHK1,同時在甘氨酸缺乏培養基中培養的ARP1細胞中上調CDC25A。相反,ATM和CHK2的磷酸化不受GSH的影響(圖。3m).這些發現表明,外源性甘氨酸剝奪誘導DNA損傷,隨后激活ATR-CHK1 DNA修復途徑,導致MM細胞S期停滯。

抑制GLDC可抑制MM細胞的增殖

甘氨酸裂解系統(GCS)由幾種蛋白質組成,包括甘氨酸脫氫酶(GLDC)、GCS蛋白H (GCSH)、氨基甲基轉移酶(AMT)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD),它們催化下列可逆反應:甘氨酸+ H4葉酸+ NAD+ ?5,10-亞甲基-H4葉酸+一氧化碳2+ NH3+ NADH + H+(圖。4a)18。我們發現外源性甘氨酸剝奪降低了NADH / NAD的比值+在ARP1和5TGM1細胞中(圖。4b),表明外源甘氨酸可以被GCS系統切割。上述RNA測序數據顯示,GLDC在ARP1細胞中被外源性甘氨酸剝奪下調,這通過蛋白質印跡進一步證實(圖。4c).為了確定GLDC是否在多發性骨髓瘤中起作用,我們在ARP1細胞中敲除了GLDC。4d).我們發現GLDC敲低抑制增殖(圖。4e),GSH水平降低(圖。4f),并降低NADH / NAD的比值+(圖。第四代移動通信技術)在ARP1細胞中。

圖4:GLDC的敲除削弱了MM細胞的增殖。
figure 4

a甘氨酸裂解系統示意圖。b用或不用外源甘氨酸培養的ARP1和5TGM1細胞中NADH/NAD +的比率。c在有或沒有甘氨酸培養24小時的ARP1細胞中GLDC、GCSH、DLD、AMT和β-肌動蛋白的蛋白質印跡d用Scramble (Scr)、GLDC shRNA1 (GLDCsh1)和GLDCsh2對ARP1細胞中的GLDC和β-肌動蛋白進行蛋白質印跡。e具有Scr、GLDCsh1或GLDCsh2的ARP1細胞的生長曲線。f具有Scr和GLDCsh1的ARP1細胞中的GSH水平。gNADH / NAD的比值+在具有Scr或GLDCsh1的ARP1細胞中。h用Scr或GLDCsh1處理或不用GSH處理的ARP1細胞的生長曲線。i用Scr或GLDCsh1處理或不用GSH處理的ARP1細胞的克隆形成分析。n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±SD;用非配對雙側分析顯著性t-測試輸入(b, fh) (p1代表Scr和GLDCsh1之間的顯著性,p2代表GLDCsh1和GLDCsh1 + GSH之間的顯著性),用ANOVA單向檢驗在(e). jGLDC,p-ATR,p-CHK1,CDC25A,γ-H的蛋白質印跡2ARP1細胞中的AX和β-肌動蛋白。k在注射了具有Scr的ARP1細胞的B-NDG小鼠中形成的腫瘤結(n= 3只小鼠)、未經GSH處理的GLDCsh1(n= 3只小鼠),或用GSH處理的GLDCsh1細胞(2 mg/kg)(n= 3只老鼠)。lScr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的腫瘤體積分析。m來源于Scr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的腫瘤結中的GSH水平。n= 3只老鼠;結果表示平均值±SD;用不成對的雙側分析顯著性t-測試輸入(l) (p1代表Scr和GLDCsh1之間的顯著性,p2代表GLDCsh1和GLDCsh1 + GSH之間的顯著性),m. nGLDC、p-ATR、p-CHK1、CDC25A、γ-H2AX和β-肌動蛋白在來源于Scr、ARP1 GLDCsh1和ARP1 GLDCsh1 + GSH小鼠的腫瘤結中的蛋白質印跡。源數據作為源數據文件提供。

接下來,我們向GLDC缺失的細胞提供外源性GSH,發現這恢復了GLDC敲除后ARP1細胞的增殖和細胞集落形成(圖。4h,我).敲除GCSH或AMT也能抑制ARP1細胞的增殖,然而,敲除催化NAD之間相互轉化的DLD+和NADH沒有顯著影響ARP1細胞增殖(補充圖。4a–f).此外,我們發現GLDC的敲除增加了γ-H2AX、p-ATR和p-CHK1,并降低ARP1細胞中CDC25A蛋白水平,而添加GSH逆轉了這些變化(圖。4j).因此,GLDC促進GSH的產生,而GLDC的敲除誘導DNA損傷并因此抑制MM細胞的增殖。

我們接下來使用免疫缺陷的B-NDG小鼠在體內檢測GLDC敲除的效果。我們給B-NDG小鼠皮下注射表達GLDC shRNA1或混雜shRNA的ARP1細胞,并在腫瘤細胞植入一周后,通過在飲用水中加入多西環素(2 mg/mL)誘導shRNA表達。我們還向一半移植了ARP1 GLDC shRNA1細胞的小鼠提供了GSH (2 mg/kg)。如圖所示。4k,l,GLDC敲除腫瘤比那些表達混亂shRNA的腫瘤小,添加谷胱甘肽增加了GLDC shRNA1小鼠的腫瘤大小。GSH測定顯示,GLDC的缺失降低了腫瘤中的GSH水平,而GSH的添加預期地恢復了含有GLDC shRNA1的腫瘤中的GSH水平(圖。4m).與體外實驗的結果一致,GDLC敲除提高了γ-H的表達2AX,p-ATR,p-CHK1,并降低腫瘤中CDC25A的表達,而用GSH治療恢復正常表達水平(圖。4n).除了甘氨酸裂解代謝19,GLDC也參與糖酵解20,21,22嘌呤合成23谷胱甘肽合成24,25,自噬26等。代謝通量實驗的結果表明,GSH (m + 1)在總GSH中的比例遠低于GSH (m + 2 ),表明來自部分GCS的GSH產量少于作為直接底物的甘氨酸。因此,我們認為甘氨酸裂解代謝只是GLDC促進MM細胞GSH合成和細胞增殖的機制之一。

甘氨酸剝奪增強硼替佐米對骨髓瘤細胞的作用

我們接下來檢查了新診斷和復發MM患者BM和PB中的甘氨酸和葡萄糖水平,發現與新診斷患者相比,復發患者表現出低得多的甘氨酸濃度,但葡萄糖濃度相似(補充圖。5a).而復發的MM患者比新診斷的患者具有更高的細胞內甘氨酸(在MM細胞中)和更低的骨髓甘氨酸(補充圖。5b).ROC曲線分析表明,甘氨酸可能有助于區分復發和新診斷的MM患者(補充圖。5c).有趣的是,添加甘氨酸,而不是葡萄糖,增加了ARP1細胞對硼替佐米(BTZ)的抗性(補充圖。5d).我們還發現BTZ處理提高了ARP1細胞的胞內甘氨酸濃度(圖。5a).這些發現使我們假設抑制甘氨酸的利用可以增強BTZ對MM細胞的作用。為了證實我們的假設,將含有(10 mg/L)或不含外源甘氨酸的ARP1細胞暴露于不同劑量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)中48小時,然后進行CCK-8分析。CCK-8結果顯示甘氨酸剝奪顯著使ARP1對BTZ敏感(圖。5b),而添加活性氧清除劑Trolox (100微米)降低了無外源甘氨酸培養的ARP1細胞的BTZ敏感性(圖。5c).這些發現表明外源性甘氨酸剝奪可以通過提高ROS水平使MM細胞對BTZ敏感。

圖5:甘氨酸剝奪使MM細胞對BTZ敏感。
figure 5

a用不同劑量的BTZ (0、2.5或5 nM)處理24小時的ARP1細胞中的細胞內和細胞外甘氨酸濃度b用不同劑量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)處理用(10 mg/L)或不用外源甘氨酸培養的ARP1細胞48小時,然后進行CCK-8分析。c用不同劑量的BTZ (0、2.5、5、10或20 nM)和用或不用Trolox (100微米)處理用(10 mg/L)或不用外源甘氨酸培養的ARP1細胞48小時,然后進行CCK-8分析。n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±SD;用不成對的雙側非參數模型分析顯著性t-測試輸入(ac). d用對照飲食喂養的組中的5TGM1 MM小鼠的腫瘤相關發光強度的實時成像(n= 6只小鼠),用對照飲食喂養并用BTZ (1 mg/kg,每周3次,n= 6只小鼠),用不含甘氨酸的飲食(n= 6只小鼠),用不含甘氨酸的飲食喂養并用BTZ (1 mg/kg,每周3次,n= 6只小鼠),或用不含甘氨酸的飲食喂養并用BTZ (1 mg/kg,3次/周)加GSH (2 mg/kg,3次/周)治療(n= 6只小鼠)。e, f5組5TGM1 MM小鼠的發光強度和血清IgG2b濃度。g骨吸收標記物CTX-I和形成標記物PINP的定量。結果表示平均值±SD;用不成對的雙側非參數模型分析顯著性t-測試中e, f (p1代表控制和控制+ BTZ之間的意義,p2代表無甘氨酸和無甘氨酸+ BTZ之間的顯著性,p3代表對照+ BTZ和無甘氨酸+ BTZ之間的顯著性,p4代表無甘氨酸+ BTZ和無甘氨酸+ BTZ + GSH之間的顯著性),g. h5組5TGM1 MM小鼠的存活曲線(對數秩檢驗)。源數據作為源數據文件提供。

我們隨后研究了體內甘氨酸剝奪是否增強了BTZ對多發性骨髓瘤的作用。將30只5TGM1 MM小鼠隨機等分為5組,其中2組用對照飲食喂養,另2組用不含甘氨酸的飲食喂養。一周后,給這些小鼠靜脈注射5TGM1細胞。另一周后,用對照飲食喂養的組每周三次腹膜內注射BTZ (1 mg/kg)或生理鹽水,用無甘氨酸飲食喂養的組每周三次注射BTZ (1 mg/kg)、BTZ加GSH(每隔一天一次,2 mg/kg)或生理鹽水。每兩周通過整體動物肝臟成像和IgG2b濃度測量來監測MM小鼠中腫瘤負荷。如圖所示。5d,e在第6周BTZ治療后,無甘氨酸組的腫瘤相關發光強度低于對照組。同時,在BTZ處理的無甘氨酸組中,加入谷胱甘肽顯著增加了腫瘤相關的發光強度。此外,BTZ處理的無甘氨酸組的血清IgG2b濃度低于BTZ處理的對照組,但通過添加GSH顯著增加(圖。5f).與不含甘氨酸的小鼠相比,對照組小鼠的CTX-I和PINP血清濃度更高,此外,在用BTZ治療的不含甘氨酸的小鼠中,用GSH治療顯著提高了CTX-I和PINP血清濃度(圖。5g).此外,BTZ + GSH處理的無甘氨酸組比單獨用BTZ處理的無甘氨酸組壽命更短(圖。5h).

我們也用NDG小鼠來證實我們的假設。給15只NDG種小鼠皮下注射ARP1細胞,然后如上所述隨機等分成5組。一周后,對照組用BTZ (1 mg/kg)或生理鹽水每周處理三次,無甘氨酸組用BTZ (1 mg/kg)、BTZ加GSH (2 mg/kg)或生理鹽水每周處理三次。BTZ顯著降低了對照組和無甘氨酸組的腫瘤體積。然而,無甘氨酸組的腫瘤比BTZ處理的對照組的腫瘤小,而添加谷胱甘肽增加了BTZ處理的無甘氨酸組的腫瘤大小(補充圖。5e).這些發現表明甘氨酸剝奪通過降低MM細胞中的GSH水平增強了BTZ對MM的作用。

阻斷甘氨酸攝取抑制細胞增殖并增強BTZ對骨髓瘤細胞的作用

甘氨酸是人體必需的神經遞質27因此可能不是可行的治療目標。我們的RNA測序分析結果顯示甘氨酸轉運蛋白SLC6A9在ARP1細胞中甘氨酸剝奪后下調,這用蛋白質印跡進一步證實(補充圖。6a).我們發現BTZ治療顯著增加SLC6A9表情卻沒有影響SLC6A5在ARP1細胞中的表達(圖。6a).因此,SLC6A9可能介導MM細胞攝取甘氨酸。為了測試這一點,我們敲了敲SLC6A9在ARP1細胞中(補充圖。6b),這導致甘氨酸濃度和谷胱甘肽水平下降(圖。6b,c). SLC6A9敲除也顯著使ARP1細胞對BTZ治療敏感,并增加BTZ誘導的ROS水平,而添加Trolox逆轉了這種效應SLC6A9敲低BTZ誘導的細胞死亡和活性氧水平(圖。6d,e,補充圖。6c–e).

圖6:通過抑制甘氨酸利用SLC6A9敲除或甜菜堿處理減少增殖并增強BTZ對MM細胞的作用。
figure 6

a SLC6A5SLC6A9用BTZ處理的ARP1中的表達。bARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2細胞中的甘氨酸濃度。cARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2細胞中的GSH水平。d用或不用BTZ處理的ARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2細胞的克隆形成分析。e用不同劑量的BTZ處理的ARP1 Scr、ARP1 SLC6A9sh1和ARP1 SLC6A9sh2細胞的CCK-8分析。f甘氨酸的化學結構,N,N二甲基甘氨酸和甜菜堿。g用以下物質處理的ARP1和5TGM1的細胞存活力N,N二甲基甘氨酸或甜菜堿。h用或不用甜菜堿處理的ARP1和5TGM1細胞中的甘氨酸水平。i用或不用甜菜堿處理的ARP1和5TGM1中的GSH水平。j用生理鹽水、BTZ (1 mg/kg)或甜菜堿(500 mg/kg)處理的5TGM1 MM小鼠的活體成像發光強度(n=每組5個)。k在2(n=每組5個)、4個(n=每組5個),以及6個(n在對照組中= 4,n=其他組5)周。l用生理鹽水、BTZ或甜菜堿處理的5TGM1 MM小鼠中的IgG2b濃度。m5TGM1 MM小鼠的存活曲線(對數秩檢驗)。n通過Chou–Talalay方法分析ARP1中甜菜堿和BTZ處理的組合指數。o用或不用BTZ和甜菜堿處理的ARP1細胞中的ROS水平。p用不同劑量的BTZ和有或沒有甜菜堿和GSH處理的ARP1的CCK-8測定。q切割的caspase3,PARP,γ-H的蛋白質印跡2ARP1和5TGM1中的AX和β-肌動蛋白,含或不含BTZ、甜菜堿和GSH。n= 3個獨立實驗;結果表示平均值±標準差(ae, gi, o, p).不成對的雙邊t-測試用于(ac, e, h, i, 好的, p);成對雙邊t-測試用于應用于(l).源數據作為源數據文件提供。

我們隨后探索了甘氨酸類似物的治療潛力N,N-二甲基甘氨酸和甜菜堿,兩者具有與甘氨酸相似的化學結構(圖。6f).我們發現甜菜堿在減少活的ARP1和5TGM1細胞的數量方面比N,N二甲基甘氨酸(圖6g)并且甜菜堿處理降低了MM細胞中甘氨酸攝取和GSH水平(圖。6h,我).為了在體內測試甜菜堿的治療潛力,我們使用5TGM1 MM小鼠,并將它們分成三組。注射5TGM1細胞一周后,三組小鼠分別用甜菜堿、BTZ或生理鹽水處理。隨著時間的推移,所有三個組的腫瘤相關發光強度都增加了(圖。6j).然而,在第6周,甜菜堿和BTZ都降低了5TGM1 MM小鼠中腫瘤相關的發光強度和IgG2b濃度(圖。6k,l).與對照組相比,甜菜堿和BTZ也顯著延長了小鼠的存活時間(圖。6m).

為了探索甜菜堿是否增強BTZ對MM細胞的作用,我們首先測定了ARP1和5TGM1細胞中甜菜堿和BTZ的IC50值(補充圖。6f,g)然后通過使用Chou-Talalay方法評估ARP1細胞中甜菜堿和BTZ的結合指數(CI)。在ARP1細胞中,甜菜堿(4 mg/mL)加上BTZ (7 nM)的CI值小于1,表明甜菜堿在其對MM細胞的作用中與BTZ協同(圖。6n).此外,用BTZ加甜菜堿的組合處理的ARP1細胞顯示出比用單一藥物單獨處理的細胞更高的ROS水平(圖。6o).此外,GSH的添加顯著降低了甜菜堿和BTZ對細胞死亡誘導的聯合作用(圖。6p,補充圖。6小時).甜菜堿和BTZ之間的協同作用通過提高γ-H2AX水平和半胱天冬酶-3和PARP的裂解在處理的ARP1細胞中得到進一步證明,這也可以通過GSH處理逆轉(圖。6q).這些發現表明,甜菜堿通過阻斷甘氨酸攝取而降低GSH水平,從而增加MM細胞中ROS水平,從而增強BTZ對MM的作用

BM微環境中甘氨酸的積累是由MMP13誘導的骨膠原降解引起的

膠原蛋白由氨基酸組成,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L-丙氨酸,其中甘氨酸約占總氨基酸的30%(圖。7a)28。我們的非目標代謝組學研究表明甘氨酸,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L與HDs患者相比,MM患者的β-丙氨酸均升高(圖。7b).此外,伴有骨溶解的多發性骨髓瘤患者的血清甘氨酸水平高于不伴有骨溶解的多發性骨髓瘤患者(圖。7c),特別是對于處于DS-III期的MM患者(補充圖。7a,補充數據5),而患有骨轉移的肺癌患者也顯示出比沒有骨轉移的患者更高的血清甘氨酸濃度(補充圖。7b).此外,MM患者中CTX-I和PINP的血清濃度與血清甘氨酸濃度呈正相關(圖。7d).總之,這些結果表明骨膠原是MM患者甘氨酸的潛在來源。

圖7:MM細胞分泌的MMP13介導的骨膠原降解增加了MM患者的甘氨酸水平。
figure 7

a骨基質成分示意圖。b甘氨酸的非靶向代謝組學分析,L-脯氨酸,L-谷氨酸,以及L-來源于MM患者的骨髓液中的丙氨酸(n= 20在訓練集組中,n=驗證集組中的30;)和HDs(n= 10在訓練集組中,n=驗證集組中的11)。c多發性骨髓瘤患者血清甘氨酸濃度(n= 12)或沒有(n= 24)骨質破壞。dMM患者血清甘氨酸濃度與血清CTX-I或PINP的相關性(n= 26).eMM患者血清MMP13與血清甘氨酸濃度的相關性(n= 87).雙面皮爾遜相關分析應用于(d, e). f體內實驗工作流程示意圖。g用生理鹽水(對照)或CL-82198 (2 mg/kg)處理的5TGM1 MM小鼠中的腫瘤相關發光強度(n=每組4個)。h圖中顯示了腫瘤相關發光強度的定量g (n=每組4個)。i來自用對照飲食或無甘氨酸飲食喂養的5TGM1 MM小鼠的股骨的顯微CT圖像。j量化骨微結構參數,包括BV/TV、Tb。n,Tb。Sp和Tb。Th(n=每組4個)。k用或不用CL-82198處理的小鼠中血清CTX-1和PINP的定量(n=每組4個)。l來自用生理鹽水或CL-82198 (2 mg/kg)處理的5TGM1 MM小鼠的血清中的甘氨酸濃度(n=每組4個)。m我們工作假說的示意圖。結果表示平均值±SD;用不成對的雙側分析顯著性t-測試輸入(b, c, j, h, k, l).源數據作為源數據文件提供。

膠原蛋白被各種腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶(MMPs)降解29,30,31,32。與早期的發現一致33我們發現ARP1細胞主要表達基質金屬蛋白酶13(補充圖7c),其濃度與骨溶解呈正相關(補充圖。7d)和甘氨酸濃度(圖。7e)在MM患者中。因此,甘氨酸積累可能是由MMP13誘導骨膠原降解引起的。

為了檢查體內甘氨酸積累的來源,我們用MMP13的特異性抑制劑CL-82198 (2 mg/kg)處理5TGM1 MM小鼠34,然后評估腫瘤相關發光、骨損傷和甘氨酸濃度(圖。7f).如圖所示。7g–I,與對照小鼠相比,CL-82198處理的小鼠在股骨中表現出顯著較低的腫瘤相關發光強度和較高的小梁骨量。此外,骨微結構參數的量化顯示,CL-82198治療增加了股骨BV/TV和Tb。n而不改變Tb。Sp和Tb。Th(圖。7j).在CL-82198處理的小鼠中,CTX-I和PINP的血清濃度顯著低于對照組小鼠(圖。7k).此外,在第6周,用CL-82198處理的小鼠中的甘氨酸濃度顯著低于用鹽水處理的小鼠(圖。7l).因此,MMP13誘導的骨膠原降解是BM中甘氨酸積累的來源。

討論

我們的結果表明甘氨酸剝奪顯著抑制MM細胞增殖。我們還表明,外源性甘氨酸被MM細胞吸收,隨后代謝為谷胱甘肽、嘌呤和絲氨酸,這與以前的出版物相反,以前的出版物中發現外源性甘氨酸僅參與黑色素瘤中嘌呤的合成14。機制研究表明,甘氨酸剝奪抑制細胞增殖,通過增加DNA損傷,從而在MM細胞中細胞周期停滯。此外,敲低GLDC,這已被證明是驅動腫瘤發生的非小細胞肺癌21,導致MM細胞GSH降低,DNA損傷增加,增殖抑制。添加GSH可有效逆轉MM中由甘氨酸剝奪或GLDC敲除引起的這些表型。甘氨酸的代謝通量分析顯示,在MM細胞中,GCS產生的GSH少于作為直接底物的甘氨酸。因此,GLDC促進GSH合成和細胞增殖可能還有其他機制。眾所周知,在HDs中,漿細胞占BM微環境中總細胞的比例不到1%;然而,惡性漿細胞的百分比在MM患者中上升到10%以上35。我們組和其他人以前的出版物表明,細胞內GSH降低了BTZ對MM細胞的作用36,37.因此,我們假設MM細胞需要外源性甘氨酸來維持細胞內GSH平衡和拮抗抗癌藥物。在這項研究中,我們發現甘氨酸剝奪增強了BTZ在體外和體內對MM的作用。有趣的是,通過甜菜堿抑制甘氨酸的利用抑制了MM細胞的增殖并增強了BTZ的抗癌作用。已經表明,高甜菜堿攝入量與各種癌癥類型的風險呈負相關,包括結腸直腸癌38,39,乳腺癌40,肝癌41和前列腺癌42.例如,Kar等人發現甜菜堿通過增加前列腺癌細胞中氧化應激介導的凋亡來抑制細胞增殖43.這些報道,以及我們目前的研究,使我們得出結論,甜菜堿與BTZ聯合應用可能是一種有前途的多發性骨髓瘤治療策略。

骨膠原是骨基質中最重要的成分之一,在多種癌癥類型中可被MMPs降解,導致骨轉移和腫瘤進展32.MM細胞誘導高水平的MMP13表達,促進骨溶解并降低MM的總存活率33,44.先前的研究表明,骨溶解與血清甘氨酸的升高呈正相關45.在目前的研究中,我們發現血清中甘氨酸濃度的增加與多發性骨髓瘤和肺癌的骨溶解有關。我們還表明,MM患者血清MMP13濃度與血清甘氨酸濃度和骨溶解相關。重要的是,用MMP13抑制劑治療5TGM1 MM小鼠降低了血清甘氨酸濃度并抑制了腫瘤進展。因此,我們的數據支持MM患者BM微環境中甘氨酸水平升高是由MM細胞分泌的MMP13介導的骨膠原降解引起的理論。甘氨酸還可能導致多種癌癥類型的骨轉移和骨溶解介導的進展。這種潛在的機制應該在未來進一步研究。

總之,我們發現BM中甘氨酸水平的升高通過調節MM細胞中GSH的平衡促進了MM的進展。無論是單獨使用還是與BTZ聯合使用,甜菜堿處理對甘氨酸利用的抑制對MM都表現出很強的治療效果(圖。7m).總之,我們的發現強調了甘氨酸在MM進展中的機制作用,并揭示了針對甘氨酸代謝的MM治療策略。


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