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一個改進的波動檢驗框架描述了結直腸癌持續細胞的群體動態和突變率

 二維碼
發表時間:2022-07-18 10:52作者:武漢新啟迪Xinqidibio

摘要

令人信服的證據表明,癌癥持久性細胞是靶向治療長期療效的主要限制。然而,癌癥持續細胞的表型和種群動態仍不清楚。我們開發了一個定量框架,通過結合實驗表征和數學建模來研究持久性。我們發現,在結腸直腸癌中,一部分持續基因緩慢復制。臨床批準的靶向治療誘導向耐藥持續體的轉變,并使其突變率暫時增加7-50倍,從而增加了持續體衍生的耐藥細胞的數量。這些發現表明,治療可能影響癌細胞的持久性和突變性,并精確抑制易錯DNA聚合酶作為限制腫瘤復發的策略。

主要的

當用靶向藥物治療癌癥患者時,通常在初始反應后觀察到腫瘤復發1,2。在長期反應和疾病穩定后出現耐藥性也很常見3,4。事實上,當癌細胞暴露于致命劑量的靶向治療時,耐藥性“持久性”細胞亞群的出現會阻止腫瘤的根除5,6,7,8,9,10。與基因耐藥細胞不同,持久耐藥細胞通過可逆、非遺傳、不可遺傳的耐藥機制來耐受藥物壓力5,10,11。然而,還不清楚持久細胞是進入靜止狀態還是緩慢地經歷細胞周期。也不知道持久表型是藥物誘導的還是預先存在的。此外,控制抗藥性持續進化的種群動態只是部分得到闡明8.

結腸直腸癌(CRC)細胞暴露于靶向治療誘導DNA損傷和DNA修復能力受損,這是最近在多項研究中證實的一種表型12,13。藥物治療導致癌細胞中容易出錯的DNA復制,這表明在治療誘導的壓力下,持久細胞的可變性會增加14.

由于腫瘤的異質性和追蹤譜系的困難,通過DNA測序測量突變過程具有挑戰性12。一個補充策略是由盧里亞和德爾布呂克開發的“波動試驗”,以描述細菌種群中耐藥性的開始15。這種分析利用克隆群體的多次復制來繞過譜系追蹤問題,并提供了一種估計突變率的優雅策略。

波動檢驗先前已被修改以推斷腫瘤對治療的獲得抗性16,17,18,19,特別是用于治療開始前預先存在的抗性細胞的進化和基礎條件下癌細胞突變率的估計20。然而,它并不是用來量化藥物治療期間癌癥持續者的突變率。

在目前的研究中,我們提出了一種通用的定量方法來表征癌細胞向持久性細胞的轉變,并測量它們在藥物治療期間的群體動態。我們采用兩步波動測試來量化CRC細胞的表型突變率。重要的是,我們的試驗區分了預先存在的耐藥克隆和持久衍生的克隆,允許定量自發(即,在未經治療的條件下)和藥物誘導的突變率。

結果

結直腸癌細胞的生長動力學

我們首先旨在量化CRC生長動力學參數是如何受藥物治療影響的。我們的實驗包括:(1)標準條件下的生長率,(2)處理下的種群動態,以及(3)持久性(補充說明).

我們使用了兩種微衛星穩定(MSS) CRC細胞模型,腎素血管緊張素系統/英國皇家空軍野生型DiFi和黑色素瘤V600E-突變的WiDr,它們分別對單獨的抗上皮生長因子受體(EGFR)抗體西妥昔單抗敏感13,21或者與BRAF抑制劑聯合使用13,兩種經臨床批準的CRC方案22,23,24。為了降低分析開始時群體中存在預先存在的耐藥細胞的可能性,我們分離了每個細胞模型的單個克隆,其生長和藥物敏感性特征與親代群體相當(補充圖。1a、b).

我們測量了標準細胞培養條件下克隆的出生率和死亡率。2,補充表1補充說明).我們從兩組藥物反應生長試驗中收集數據(圖。1a).第一個是劑量反應分析,其中CRC克隆暴露于濃度增加的靶向治療(圖。1b和擴展數據圖。1a),用于分析定義為活細胞數量對時間和藥物濃度的生長曲線(圖。1c和擴展數據圖。1b)并對藥物治療中生長和向持久狀態轉變的交織過程進行量化。補充圖3顯示了用于獲得生長曲線的劑量反應分析數據的標準化過程(補充說明).第二個是單劑量試驗,包括暴露于恒定藥物濃度3周,強調了雙相(兩個時間尺度)殺滅曲線(圖。1d和擴展數據圖。1c),其特征是敏感細胞快速下降,然后是較慢的下降25,26,這是細菌中出現持久細菌的標志25。存活的持續體部分顯示細胞數量緩慢但可測量的衰減(擴展數據圖)。2),表明堅持者有隨著時間推移慢慢死亡的趨勢。

圖1:響應靶向治療的CRC克隆的群體動態。
figure 1

a,對CRC克隆進行的藥物篩選生長曲線分析的示意圖。b在劑量反應分析中,用遞增濃度的dabrafenib(Dab)+50μg/ml處理WiDr細胞?1西妥昔單抗(CTX),而DiFi細胞接受濃度增加的CTX。在指定的時間點通過ATP試驗測量細胞活力。結果代表平均標準差(n= 3個針對WiDr的生物學獨立實驗;nDiFi的5個生物學獨立實驗)。c治療中指定細胞的生長曲線,報告為活細胞的倍數變化(對數標度)對藥物暴露時間,通過使用第0天測量的存活力在指定時間點標準化細胞存活力,從劑量反應分析數據計算。每個克隆的三種不同藥物濃度的生長曲線顯示為平均標準差(n= 3表示WiDrn對于DiFi = 5)。d在單劑量試驗中,活細胞的倍數變化(對數標度,通過ATP試驗評估)對指示細胞的藥物暴露時間?;罴毎目倲捣暇哂袃蓚€時間尺度的指數衰減,支持持久細胞的生長(虛線表示初始斜率)。符號表示手段(n= 2個生物學上獨立的實驗)。

CRC持久性細胞在藥物治療期間緩慢復制

我們接下來試圖闡明在藥物治療下持續增殖和死亡的動力學。用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)對CRC持久體進行染色,羧基熒光素琥珀酰亞胺酯是一種細胞滲透性熒光染料,允許對細胞分裂進行流式細胞術監測27,和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU),一種在活性DNA復制過程中有效整合到DNA中的修飾胸苷類似物,揭示了0.2%和2.5%之間的部分持續體在治療過程中緩慢復制(擴展數據圖)。3a–c補充說明),符合最近的數據28。我們接下來使用活細胞顯微成像分析(補充說明).盡管大多數CRC持久體是非復制性的,但在所有分析的CRC克隆中細胞分裂事件是可見的(擴展數據圖。三維(three dimension的縮寫)和補充視頻14).細胞分裂偶爾是成功的和可行的(擴展數據圖。三維(three dimension的縮寫)).我們還檢測了細胞分裂后和未分裂細胞中的細胞死亡事件(擴展數據圖。3e、f).

持續表型是由CRC中的靶向治療誘導的

為了量化藥物治療期間的細胞群體動態,我們開發了一個CRC細胞向持久狀態轉變的數學模型,我們稱之為“轉變為持久狀態”(TP)模型。該模型將出生-死亡參數和表型轉換納入確定性極限(即忽略隨機人口效應引起的波動,參見補充說明)29,30。數字2a總結了TP模型的動力學。我們利用該模型來量化轉換率,并評估持續存在的亞群是否先于藥物施用,或者持續存在的表型是否在藥物治療中出現。TP模型考慮了藥物處理的細胞的三種可能的命運:(1)死亡,(2)復制和(3)以一定的速率轉換到持續狀態,λ在藥物存在的情況下;它進一步考慮預先存在的任意穩定分數f0持久者(圖。2a).

圖CRC持久細胞的出現主要是藥物依賴性的。
figure 2

a,恒定藥物處理下細胞群體動態的示意圖。當癌細胞接受靶向治療時,存活細胞的數量開始下降。敏感細胞(灰色細胞)的同質群體將呈指數縮小直至消失(灰色虛線)。一些細胞在藥物治療后存活下來,因為它們以一定的速度轉變為持久表型(暗黃色細胞,暗黃色線)λ殘留細胞(黑色實線)顯示出雙相衰減。有限部分的持久單元(f0)可能在藥物治療前存在于人群中(f0?>0,暗黃色虛線)或不(f0= 0,深黃色實線)。持續細胞在治療期間表現出降低的死亡率,這導致細胞群體緩慢的指數下降(暗黃色虛線)。b,治療下CRC克隆的生長曲線,由劑量-反應分析計算。黑色符號和條形代表劑量反應數據集的平均標準差(nWiDr的3個生物學獨立實驗,nDiFi的5個生物學獨立實驗)。實線表示TP模型適合于不同持續細胞初始分數值的實驗數據(f0顏色編碼)。c根據單劑量數據集評估的所示細胞的活細胞相對于藥物暴露時間的倍數變化。黑色符號代表實驗數據的平均值(n= 2個生物學上獨立的實驗)。黑色虛線表示TP模型與數據的擬合,而暗黃色實線表示持久細胞的預期比例。d描述持續細胞動力學的TP參數的聯合后驗分布(等值線圖,用歸一化似然函數進行顏色編碼)和邊緣化后驗分布(左圖和下圖,灰色區域表示概率密度函數):(1)持續細胞的初始分數(f0下圖)和(2)對持久細胞敏感的轉換率(λ)誘導的藥物治療。似然函數測量模型與實驗數據的一致性,作為所考慮參數值的函數。

下面的等式定義了敏感(X(t))和persister(Z(t))根據TP模型的細胞(在藥物治療下):

$ $ \ left \ { { \ begin { array } { * { 20 } { l } } { { \ mathrm { D } } } { { \ mathrm { D } t } } { { X } } \ left({ t } \ right)} \ h fill & = \ h fill & { \ left({ B-D \ left({ \ left[{ { M } } \ right } } \ right)} \ right){ { X } } \ left({ { t } } \ right)-\ lambda \ left({ \ left[{ { M } } \ right$$
(1)

在哪里BD([M])分別是敏感細胞的出生依賴性和藥物依賴性死亡率,而[M]為藥物濃度。持續存在者以藥物依賴的轉換率出現λ([M]).在藥物治療下,頑固者會以一定的速度死亡Dp?>0(擴展數據圖23).該模型假設在獲得抗藥性突變之前試圖分裂的持續體會死亡;因此,在藥物存在的情況下,從持久性到敏感性的可能回切將有效地增加死亡率(補充說明).

指定等式(1)的解的初始條件是量化藥物治療誘導向持久狀態轉變的程度的關鍵。具體地說,如果敏感到持久的轉變完全是藥物誘導的,那么未治療的群體將不含有任何持久的,也就是說,\(f _ 0 = \ frac { { Z \ left({ t _ 0 } \ right)} } { { N { \ left({ t _ 0 } \ right)} } = 0 \).

相反,如果一些持久化細胞預先存在,那么最初部分的持久化細胞具有有限的正值(f0> 0).如果f0是非常小的,一些持續者可能預先存在,但過渡主要是藥物誘導的。如果f0實際上相當于幾周治療后的殘留持久性的分數,那么向持久性的轉變不是藥物誘導的。

為了確定最可能的情況,我們使用了從藥物反應分析中收集的實驗數據(圖。1).使用劑量反應分析的結果,我們定義了在短時間內控制模型動態的參數,例如持久性的初始分數f0和被處理細胞的有效生長率。類似地,單劑量測定用于量化影響長期動力學的模型參數,例如對持久性細胞(λ)和持續者的有效死亡率(Dp).通過約束來自實驗數據的模型參數,我們建立了最能描述基于細胞的結果的方案。推斷的參數與通過活細胞顯微鏡檢測獲得的值一致,支持增殖和細胞死亡之間的平衡稍微偏向后者(擴展數據圖。3g補充說明).

在治療過程中,細胞數量在1-3天內開始下降(t0),取決于初始播種密度(補充圖。4).一旦生長曲線被縮放(在時間上和在測量的存活力上)到達到的最大值,在具有不同接種密度的實驗中觀察到的細胞動力學是一致的t?=?t0(補充圖4).

TP模型的參數用兩種細胞系的標準貝葉斯推斷框架進行推斷(補充表2補充說明).與WiDr相比,DiFi顯示出較慢的“死亡”動態。有鑒于此,在WiDr中,我們對劑量反應和單劑量數據集進行了聯合擬合,而在DiFi中,我們評估了長達19天的多劑量靶向治療的生長曲線,這允許僅基于劑量反應數據集進行模型擬合(補充說明).

我們確定了給定實驗數據的最佳TP模型參數,考慮了不同的持久化器初始數量值(f0).推斷的TP模型和實驗數據之間的最佳擬合出現在f0= 0,而當f0增加;我們注意到值f010%的誤差已經導致了與數據的巨大偏差(圖。2b).因此,TP模型與主要由藥物誘導的持續表型是一致的。此外,該模型恰當地描述了單劑量分析的動力學(圖。2c).

為了進一步證實TP模型的有效性,我們接下來將重點放在描述持續者動態的兩個模型參數的貝葉斯統計上:轉移率λ和持久者的初始分數f0。這兩個參數的貝葉斯推斷的聯合后驗分布如圖。2d和補充圖。5。我們發現持續的轉換率λ當考慮持續者的初始分數的不同值時,模型擬合的估計值不變f0(圖。2d).的邊緣化后驗概率f0峰值為零(圖。2d下圖),其上限遠小于持續種群大小(在所有持續細胞出現后)與治療開始時的總種群大小之比。這意味著轉換率的推斷值λ獨立于f0TP模型與實驗數據的一致性最好f0= 0.

最后,為了比較這些場景f0= 0且f0> 0,我們使用了貝葉斯信息標準(BIC)和赤池的信息標準(AIC),這是用于模型選擇的標準貝葉斯標準。根據這兩者,TP模式與f0= 0優先于f0> 0(擴展數據圖。4,補充表3補充說明).我們在補充表中總結了最適合的TP模型參數4。有趣的是,我們發現WiDr和DiFi細胞向持久細胞的轉換率是藥物依賴性的(擴展數據圖。4和補充圖。6).這些結果表明,即使在藥物治療前人群中存在很少的持續者,但他們中的大多數在藥物暴露后一定已經轉變為持續表型。我們發現WiDr細胞表現出隨藥物濃度增加而持續的轉換率,這一發現可用于設計創新策略來限制持續進化。值得注意的是,我們的分析預測,與恒定劑量相比,藥物濃度的線性增加可能會減少持久性的數量(擴展數據圖。5).

持久分布支持藥物誘導的情況

然后,我們測量了多孔中持續體的數量如何變化,因為該參數的分布在藥物誘導和預先存在的情況下預計是不同的31。我們播種了DiFi cl。B6和韋德cl。在多個96孔板中進行B7,并在3周的藥物治療后,在> 400個獨立的孔中定量化持久細胞的分布(殘余細胞活力)(擴展數據圖。6a).觀察到的井間豐度分布符合泊松分布(擴展數據圖。6b),支持藥物誘導的情況,如計算模擬所證實的(參見參考文獻。31一個類似的方法被用于突變過程和擴展數據圖。6c).這些數值模擬表明,假設在藥物治療前不存在持續體,在治療下從敏感細胞中出現的持續體的數量是泊松分布的。相反,在治療實施之前,先存在的持續者將以恒定的速率從指數增長的人群中產生。因此,預先存在的細胞數量不是泊松分布,而是由盧里亞-德爾布呂克描述的15分布(有方差?均值)。我們發現,持續體在各孔中的最終分布是泊松分布,與藥物治療后的出現一致。

波動分析量化了持續者的突變率

在不存在或存在抗癌藥物的情況下測量突變率需要開發第二個模型,此后稱為“哺乳動物細胞-魯利亞-德爾布呂克”或“MC-LD”模型。MC–LD模型是一個完全隨機的出生-死亡分支過程,描述了藥物治療前和治療期間耐藥細胞的生長(圖。3a).我們指定μ一個個體(細胞)產生抗性的有效速率μsμp分別顯示敏感(未處理)和持久細胞的突變率(圖。3b補充說明).

圖3:測量哺乳動物細胞突變率的改良盧里亞-德爾布呂克波動試驗。
figure 3

a,基于推斷的群體動力學和MC–LD模型的修正波動檢驗允許估計自發(μs)和persister(μp)突變率。b,波動測試期間CRC細胞的細胞群體動態的示意圖。在沒有藥物治療的初始擴增期間,CRC細胞以自發突變率(μs).當細胞暴露于靶向治療時,預先存在的耐藥細胞被藥物選擇,并產生早期出現的耐藥集落(紅色虛線),而敏感細胞的數量開始下降(黑色實線),并轉變為持久狀態(暗黃色實線)??剐约毎麃碓从诰哂型蛔兟实某志眉毎?/trans>μp并產生晚生抗性菌落(藍色虛線)。c,波動分析基礎實驗設計的示意圖。將WiDr和DiFi細胞接種在20個96-多孔板中,總共1,920個孔,并允許在沒有藥物的情況下擴增約8代(達到約20,000個細胞/孔)。擴增后,所有的孔都用靶向治療(100μg/ml?1用于DiFi的西妥昔單抗和1個微米達布拉芬尼+ 50 μg ml?1西妥昔單抗用于WiDr)。d,在MC–LD實驗性測定中鑒定了兩組抗性克隆:早期出現的抗性克隆在3–4周后生長(階段1 ),晚期出現的抗性克隆在持續藥物治療> 10周后出現(階段2)。比例尺,100 μme,柱狀圖列出了在MC–LD實驗中每個CRC克隆的指定時間點計數的抗性克隆數。紅色柱表示早期出現的抗性克隆(出現在藥物治療的前4周);藍條表示晚期出現的抗性克隆(在≥10周的藥物治療后出現)。顯示了每個克隆的兩個獨立生物重復的結果。

將WiDr和DiFi細胞分別接種在20個96-多孔板中,并允許其在無藥物的標準培養條件下生長固定數量的細胞分裂(圖。3c);之后,應用恒定的臨床相關藥物濃度(圖。三維(three dimension的縮寫)).孔的數量、每個孔中的初始群體大小和沒有藥物治療時的細胞復制時間是通過理論上的考慮結合我們之前測量的群體動力學參數來設定的(補充表格14補充說明).

根據我們以前的工作6,在治療3-4周后,檢測到少量早期出現的耐藥菌落(圖。3d,e).相反,在絕大多數孔中,敏感細胞死亡,而藥物耐受持續細胞存活,如通過測量剩余細胞存活力所檢測的(擴展數據圖。6)6。在持續處理殘留的持久性細胞數周后(圖。三維(three dimension的縮寫)),晚出現的抗性菌落出現在先前檢測到持續存在的孔的子集中(圖。3d,e).

我們運行了多個MC–LD模型模擬,使用TP模型推斷的輸入參數,發現在晚期時間點出現的耐藥克隆(> 4周的治療)不太可能來源于預先存在的耐藥細胞(圖。4a和擴展數據圖。7).根據以前的工作6,我們認為在藥物治療的前4周內顯微鏡下可見的耐藥菌落(早期出現耐藥)代表預先存在的耐藥細胞,即在擴增期通過自發突變出現的突變細胞。我們還推斷,在藥物治療≥10周后在含有持久性細菌的孔中緩慢出現的耐藥菌落(晚期出現耐藥)可能通過我們和其他人觀察到的適應性突變過程產生了耐藥突變12,13(圖。4a和擴展數據圖。7).

圖4:持久細胞中突變率的定量。
figure 4

a圖2中描述的試驗的模擬數據。3。敏感細胞和持久細胞(暗黃色實線)的實驗測量的MC–LD模型參數和模型衍生的突變率估計值用于模擬預先存在的(紅色)和持久衍生的(藍色)耐藥細胞的出現時間。b,量化MC–LD實驗中敏感(紅色)和持久(藍色)細胞的突變率。所示的細胞模型按照圖1所述進行接種和處理。3。突變率由實驗數據計算,基于群體參數和預先存在的(早期出現)和持久衍生的(晚期出現)抗性克隆的數量,如圖。3。結果表示推斷的突變率(對于敏感細胞和持久細胞的每個克隆),柱狀圖顯示突變率的后驗分布的平均值(n= 2個生物學上獨立的實驗)。這里,柱狀圖被用作推斷突變率的圖示(見補充表5對應的數值)。c通過模型模擬驗證突變率估計值。箱線圖代表了估計突變率的分布n=使用補充表格中報告的參數,對整個實驗進行100次獨立模擬14。紅色和藍色方框分別表示敏感和持久突變率估計值的四分位數范圍(第25和第75個百分位數),而上下須代表分布的最大值和最小值。分布的中間值,報告為中間的黑線,與其95%的置信區間(細微差別區域)一起顯示,由方框兩側的凹口表示。模擬中使用的突變率的分布平均值和輸入值分別用白色虛線和黑色虛線表示。d聯合后驗分布(等高線圖,用歸一化似然函數進行顏色編碼)和邊緣化后驗分布(左圖和下圖,灰色區域顯示概率密度函數)( 1)持續細胞的初始部分(f0下圖)和(2)與敏感細胞的突變率相比,持久細胞的突變率增加了1倍(μp/μs).似然函數測量模型與實驗數據的一致性,作為所考慮參數值的函數。

在標準波動測試中,突變率可以從觀察到的含有耐藥細胞的孔的比例中推斷出來。在該模型中,該分數對應于在給定時間間隔內在孔中觀察到抗性克隆的預期概率[0,T].為了在MC–LD模型中計算這種概率,我們假設耐藥細胞以一定的速率分裂b和死亡的速度d,就像未經處理的細胞一樣。補充圖7支持突變率推斷值相對于耐藥細胞分裂率變化的穩定性。作為繁殖波動(遺傳漂變)的結果,攜帶抗藥性突變的細胞仍然可能滅絕,并且只有一小部分突變體,我們稱之為“已建立的突變體”,在隨機漂變中存活。在一個時間間隔內幸存的隨機漂移的概率∮t,此處表示為ψ(Δt),是一個眾所周知的生滅過程的結果32,33 (補充說明).

通過考慮在時間間隔[0]內建立的突變細胞的數量,我們解析地導出了該模型的近似解,T]遵循具有期望值的泊松分布\({ { { \ mathcal { M } } } \ left(T \ right)\)。因此,具有至少一個突變體的概率由下式給出:

$ $ p \ left(t \ right)= 1-{\mathrm{e}}^{-{ { { { \ mathcal { m } } } \ left(t \ right)}。$$
(2)

為了量化給藥前癌細胞的自發突變率,我們將重點放在當時建立的耐藥細胞上T款待治療前給藥。在此時間間隔內從敏感細胞中出現的抗性細胞的預期數量為:

$ $ { { { \ mathcal { m } } } _ { { \ mathrm { sensitive } } } \ left({ t _ { { \ mathrm { treat } } } } \ right)= \ mu _ { \ mathrm { s } } \ mathop {\int}\limits_0^{t_{{\mathrm{treat}}}} x \ left(t \ right)\ psi \ left({ t _ { { \ mathrm { treat } }-t } \ right){ \ mathrm { d } } t { { { \ mathrm {,}}}}$$
(3)

在哪里μs就是敏感細胞的突變率。

為了量化持久細胞的突變率μp我們考慮當時出現的耐藥細胞T從藥物治療開始。從持續細胞中出現的抗性細胞的預期數量為:

$ $ { { { \ mathcal { m } } } _ { { \ mathrm { persisters } } } \ left(t \ right)= \ mu _ { \ mathrm { p } } \ mathop {\int}\limits_0^t z \ left(t \ right)\ psi \ left({ t-t } \ right){ \ mathrm { d } } t . $ $
(4)

我們強調方程式(2)–(4)連接到TP模型的解,方程(1)。因此,MC–LD模型的解是根據用TP模型估計的相同參數定義的(補充說明).

我們使用MC–LD模型的這個解來推導敏感細胞突變率的估計值μs(包括具有早期出現的抗性細胞的孔的部分)和持久細胞μp(對應于具有晚出現抗性克隆的孔的分數)。

持續者在治療中顯示出突變率增加

通過兩步MC–LD波動測試為每個克隆收集的數據允許推斷敏感(μs)和persister(μp)細胞。我們保守地將突變過程評估為時序性的(以每天的突變數來衡量)而不是復制性的(每一代的突變數)。這種選擇是安全的,因為顯示兩種表型的細胞的復制突變率之間的比率必須總是高于按時間排列的比率,因為(除了任何不確定性之外)持久細胞中測量的細胞分裂與未處理的細胞相比非常低。

我們發現,在存活并耐受了幾周劑量的靶向治療的細胞中,突變率增加了7-50倍,這些靶向治療對大多數親代群體是致命的(圖。4b和補充表格5).在DiFi和WiDr細胞中,以及對EGFR阻斷或EGFR/BRAF伴隨抑制的臨床相關濃度的反應中,該結果在多個生物重復中是一致的(圖。4b和補充表格5).

為了進一步驗證基于MC–LD模型的突變率推斷的一致性,我們使用一組敏感的(μs)和persister(μp)突變率,然后我們對合成數據使用MC–LD估計量。數字4c比較模擬實驗重復的估計突變率的箱線圖,突變率的實際值用作模擬的輸入。這些值之間的一致證實了我們的估計。

我們接下來評估了突變率的推斷值是否以及在多大程度上受到不同數量的預存持續細胞的影響f0在貝葉斯框架內使用我們的估值器(圖。4d).這種方法返回突變率,考慮一系列的實際值f0以及它們的概率。我們獲得了持久細胞突變率的倍數增加,作為f0在與圖1和圖2中實驗評估的生長曲線測定中觀察到的動力學相容的整個值范圍內。12。數字4d總結了這個推論的結果。我們發現,考慮到所有有代表性的f0這與我們的實驗數據一致,持續細胞中突變率的增加仍然得到有力的支持。

為了證實這些結果,我們重復了全套實驗,并為另外兩個克隆運行了分析管道,每個細胞模型一個(WiDr cl。B5和DiFi cl。B3),從而證實了我們的發現,并排除了克隆偏倚效應(擴展數據圖。89).從波動分析中分離出的持續衍生的抗性克隆的分子譜顯示,在RAS-MEK途徑中涉及的基因中獲得了單核苷酸變異(SNVs)或拷貝數改變(CNAs ),這是CRC中對抗EGFR/抗BRAF抑制劑的抗性的已知驅動因素21,34,35(補充圖8和補充表格6).

我們為暴露于靶向治療的CRC細胞的進化動力學提出了一個定量模型(圖。5a).未經治療的癌細胞以復制突變率復制并自發獲得可賦予靶向治療抗性的突變(預先存在的抗性突變)μs。然而,當細胞暴露于靶向治療時,大多數細胞會迅速死亡,而一部分親代細胞會以一定的速度轉變為長期存活的持續狀態λ并且是以藥物誘導的方式。先前和當前的發現表明,持續細胞在持續暴露于致命劑量的藥物下,會啟動影響DNA復制保真度的應激反應12,13,從而導致其突變率的顯著增加(μp),因此增加了產生耐藥性的可能性。

圖5:抑制易錯DNA聚合酶延遲了對靶向治療的獲得性抗性的發生。
figure 5

a,藥物治療期間CRC細胞突變動力學的示意圖。未處理的細胞以復制自發突變率自發獲得抗性突變μs。當癌細胞暴露于靶向藥物時,以藥物依賴的方式誘導存活的持久表型。持續藥物暴露下的持續細胞降低了DNA復制保真度,并以一定的速率增加了它們的突變率μ頁(page的縮寫)這反過來又增加了遺傳多樣性,并有利于耐藥克隆的出現,從而導致腫瘤復發和治療失敗。b所示的CRC細胞用抗EGFR抑制劑西妥昔單抗(CTX)單獨治療或與抗BRAF抑制劑dabrafenib (Dab)聯合治療;根據指示添加REV1抑制劑(REV1i)。在治療期間監測細胞的數量,直到出現耐藥性(n=每個細胞系1個生物學實驗)。

誘變REV1的抑制擴展了靶向治療的功效

我們以前報道過,作為對藥物治療的反應,癌細胞通過下調DNA修復基因和上調專門的易錯DNA聚合酶,從高保真度DNA復制轉變為低保真度DNA復制13。反過來,這可以促進在持續細胞中觀察到的突變率的暫時增加,正如本研究中定量測量的那樣。在靶向治療的癌細胞中上調的DNA聚合酶中13,REV1進行跨損傷合成(TLS),這是一種誘變過程,允許細胞通過繞過阻斷正常DNA復制的損傷來耐受DNA損傷,從而導致突變的引入36,37。使用REV1抑制劑干擾TLS已被證明可增強化療效果并抑制體外和體內的腫瘤生長38,39?;谝陨纤?,我們假設對誘變TLS的抑制可能會增加靶向治療誘導的DNA損傷的細胞毒性效應,從而延遲適應性突變過程中的抗性獲得。

為了評估這種可能性,我們進行了進展時間(TTP)分析,這是我們以前建立的方法40以監測癌細胞中二次耐藥性的發展。DiFi和WiDr CRC細胞,以及黑色素瘤V600E突變的細胞系(JVE207)用MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)途徑抑制劑、REV1抑制劑或它們的組合進行處理。對REV1的藥物阻斷顯著延遲或阻止了對EGFR/BRAF抑制劑的繼發性耐藥(圖。5b和擴展數據圖。10).

討論

我們提出了一個實驗框架,整合了生物測定和數學建模來研究暴露于環境擾動的細胞系的群體動力學。MC–LD分析允許對自發突變率和藥物誘導突變率進行定量比較,并且原則上可用于測量在相當多的生物系統中,各種環境條件是否以及如何影響持續表型和哺乳動物細胞的突變率。

我們的技術的一個重要警告是波動測試測量“表型”突變率,即轉化為表型(這里是對靶向治療的抗性)的比率,這可能是由不同的突變途徑引起的,包括SNVs和CNAs,我們發現這兩種途徑都在我們的持久耐藥克隆中產生抗性。然而,我們的方法具有繞過與基于測序的突變率測量相關的幾個障礙的優勢。

雖然我們和其他人最近已經證明適應性突變通過增加存活的持續細胞的基因組不穩定性來促進二次抗性的獲得12,13由于缺乏定量描述持續治療者行為的模型,迄今為止還無法對持續治療者的突變率進行可靠的量化。盡管受限于細胞系,我們的受控兩步波動分析克服了這些問題。這些結果可用于推斷更復雜系統的特征(如患者樣本),在這些系統中,數學模型是假設的,不能進行類似的驗證。

我們的結果表明,藥物誘導的敏感到持久的轉變是這種表型發展的主要途徑。這與最近化療誘導的CRC持續狀態的證據一致41。雖然我們的結果可以用對持續細胞敏感的表型轉換的存在來解釋,但是還沒有對這種轉換的直接觀察。增殖較慢的耐受細胞產生增殖較快的非耐受表型的替代模型也將產生雙相殺傷曲線42,43。在我們的框架中,這將對應于以下情況f0??0,這是我們分析排除的。因此,將表型轉變與持續治療聯系起來的解釋似乎是最有可能的情況。

重要的是,即使是一小部分先前存在的持續體也不會影響我們的發現,即癌細胞的突變率在治療下顯著增加。持續幾周的藥物治療后,持續產生的耐藥克隆不斷出現。在突變率沒有增加的情況下,根據敏感(未處理)細胞的突變率,通常需要(保守估計)> 100–1000周,單孔中的細胞才會產生耐藥性。相當于在2 × 10上進行的波動分析5–2 × 10610周后,要求wells觀察一些抗性克隆。此外,敏感細胞對抗性的貢獻在幾周的治療后耗盡,因為我們表明它們在幾天內就滅絕了(圖。1d).活躍的細胞周期進程的證據,以及持久性細胞中誘變率的增加,進一步支持了先前關于正在進行的適應性誘變促進獲得抗性的發現13.

最近的一項研究得出結論,適應性突變對蛋白質編碼基因組突變負荷的影響很小44。這與以前的發現一致,以前的發現表明獲得治療抗性的細胞中腫瘤突變負荷沒有強烈增加12,13。在這些不精確控制的系統中有許多混淆因素。事實上,適應性突變表型可能在時間上受到限制(即,當細胞不適應新環境時13),局限于一個小的細胞亞群,并被預先存在的抗性細胞的生長所掩蓋。復發時對腫瘤樣本的批量分析無法理清這些因素。我們對持續者動態和突變率增加的描述具有潛在的臨床相關性。首先,發現較高的藥物濃度誘導敏感細胞的死亡率增加,并增加向持久性的轉變,持久性是耐藥性出現的儲庫,這為削弱持久性出現的治療策略提供了理論基礎。第二,易錯DNA聚合酶在適應性突變中的參與13為限制耐藥性的非顯而易見的組合策略提供了機會。事實上,我們表明抑制誘變TLS有效地延緩了繼發性耐藥的獲得。

我們的方法推斷,臨床批準的抗癌療法可以誘導CRC細胞突變率的暫時增加。我們的框架可用于系統地測量暴露于各種環境應激源的哺乳動物細胞的突變率,并定義藥物組合以限制治療耐藥性的出現。


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