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哺乳動物細胞總RNA的分離

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發表時間:2020-07-29 16:51作者:武漢新啟迪生物Xinqidibio來源:www.donghu8.com

哺乳動物細胞總RNA的分離

哺乳動物細胞總RNA的分離

細胞的裂解
提取步驟
注意事項

  這一從培養的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序系為Favaloro 等(1980)所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA,因為用這種裂解細胞的方法(在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化)去消化組織速度很慢,導致內源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時間發揮作用。原方案中(Favaloro等。1980)采用的裂解緩沖液含有0.015 %(W/V)的Macaloid(硅藻土),用于吸附并滅活RNA酶。盡管現仍有Macaloid出售NL Chemicals), 但氧釩核糖核苷復合物和RNA酶的蛋白質抑制劑更常用。下述程序的優點是速度快,并能同時處理很多樣品。

一、細胞的裂解

單層細胞的裂解
懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解

a.單層細胞的裂解
a吸出培養液,以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞,重復1次,將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上,再將鋁板置于冰盤上。
b直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液, 并使之遍布整個平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT
100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物
c0.5ml蛋白酶消化緩沖液,用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2SDS
d用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。重復34次,剪切DNA。
c加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存,貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。

b.懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a4℃以2000g離心5分鐘收集細胞,以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀,洗滌細胞3次,每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀,使其徹底分散。
b估計細胞沉淀的體積,用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液,用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。重復34次,剪切DNA。
d加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存,貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。

二、提取步驟

1用等體積酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白質。
2用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相, 將水相吸至一個新的離心管內,加2.5倍體積用冰預次序的乙醇,充分混勻, 于0℃放置1小時。
30℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA,棄上清,用含0.1mol/L 乙酸鈉(pH5.2)的70%乙酸洗滌沉淀,用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡, 隨后于室溫放置幾分鐘,晾干沉淀。切勿抽干沉淀,因為干的核酸沉淀很難溶解。
4每個直徑為90mm的培養皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
5分別按10mmol/L0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇(DTT),然后分別按1000單位/10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。
6加入無RNA酶的胰DNAI至終濃度為2μg/ml,混勻,于37℃溫育60分鐘。
7分別按10mmol/L0.2%的終濃度加EDTASDS。
8用等體積酚:氯仿抽提1次。
9于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相, 將水相吸至另一個離心管內,加3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L,加2.5倍體積用冰預次的乙醇,充分混勻,冰浴放置2小時。
10用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。
11吸出所有的乙醇,將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘,讓最后殘存的痕量乙醇揮發干凈。
12200μl TEpH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-70 ℃貯存備用?;厥?/span>DNA時,只須取出1小份貯存液,加入3mol/L乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度為0.3mol/L,充分混勻,用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。

三、注意事項

1.測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液[步驟13]離心沉淀RNA,以400水重溶, 測定OD260 值, OD2601RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2.如果需要,可用oligo(dT) -纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA購買試劑盒進行mRNA的純化。
3.某些情況下(例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時),必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則,當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題, 反轉錄過程中法染的模板DNA片段可能會與RNA雜交而充當引物,從而導致物定mRNA5'末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。
a)步驟12后,加200μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),用自動微量移液器反復吹吸,以重懸核酸沉淀,將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。
b)用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘,RNA沉于管底,而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。
c)棄上清液,用200μl TEpH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),分混勻,加入550μl用冰預冷的乙醇?;靹蛉芤?, 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12 000g離主10分鐘,以回收RNA。小心吸出上清。d)棄上清液,用300μl TEpH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-70℃貯存備用。
回收RNA時,只需取出1小份貯存液,加3mol乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度為0.3mol/L充分混勻,用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物,用含0.1%羥喹啉的苯酚[0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]RNA終溶液抽提數次即可。
4. 對大多數細胞株來說, 一個直徑90mm 培養甲中培養的RNA收率為100-200μg


文章分類: 分子技術資料
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